[发明专利]香菇L03、Cr02或沪农1号的分子特异性标记引物及检测方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及香菇L03、Cr02或沪农1号菌种的分子特异性标记引物，以及利用该引物对香菇L03、Cr02或沪农1号菌种进行鉴别和检测的方法。

(二)背景技术

香菇Lentinula edodes因其美味和具有重要的食、药用价值而倍受国内外消费者的喜爱，是我国商业化生产规模最大和世界上产量仅次于双孢蘑菇的食用菌。但长期以来，由于我国食用菌菌种鉴定与检测技术研究的落后和菌种行政管理机构与法规的不健全，无法适应近十几年来代料香菇生产的迅猛发展，香菇主产地菌种生产、销售极为混乱，“异种同名、同种异名”现象普遍存在，假种、劣种充斥市场，已极大地损害了香菇育种者和生产者的利益。我国是世界人工栽培香菇的发源地和香菇产量最大的国家，有着丰富的香菇种质资源，随着日本《种苗修正案》的出台，建立起一套香菇菌种的快速鉴定检测技术势在必行，这不仅有利于我国香菇种质资源的发掘与利用，更好地为选育具有我国自主知识产权的优良香菇品种服务，而且也是规范现阶段混乱的香菇菌种市场的迫切需要。

传统的香菇菌种鉴别以子实体形态、生长特性以及生理生化反应特征为依据，但由于易受环境因素和生理状况的影响，对形态差异较小的种间及种内菌株难以鉴别，而且很难在短时间内对处于菌丝体状态的菌种进行鉴定和检测。分子生物学技术的快速发展，特别是分子标记技术的建立与成熟，为发展简便、快速、准确的菌种鉴定技术提供了有效手段。SCAR(Sequence CharacterizedAmplified Region，特征性片段扩增区域)标记是1993年由Paran和Michelmore在RAPD基础上提出的，它基于对特异RAPD片段的测序，根据两端序列设计一对18-24碱基的引物，在较高的退火温度下进行特异扩增实现的，其专一性引物的采用排除了随机引物结合位点之间的竞争，因而它是一种十分稳定的分子标记，在应用上具有迅速、简便、低成本的特点。

(三)发明内容

本发明目的提供香菇L03、Cr02或沪农1号菌种的分子特异性标记引物，以及一种能对香菇L03、Cr02或沪农1号菌种进行快速鉴定的方法。

本发明采用的技术方案是：

香菇L03、Cr02或沪农1号菌种的分子特异性标记引物，所述引物序列为：

上游引物5′-ATCCGAAGCTCTTCAGTAAAC-3′；

下游引物5′-TGCCGAAGTATATCAAG-3′。

该引物对是采用PCR技术，经过大量筛选试验，采用RAPD标记为引物获得香菇L03、Cr02和沪农1号菌种的特异性DNA片段，将该片段克隆测序，以得到DNA序列为基础，所设计的特异性扩增引物，以该引物对香菇L03、Cr02或沪农1号菌种进行PCR扩增，均可获得493bp大小的特异性片段。

本发明还涉及对香菇L03、Cr02或沪农1号菌种进行鉴定和检测的方法，所述方法为：提取待测香菇菌种基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现493bp的DNA条带，则待测菌种为香菇L03、Cr02或沪农1号菌种中的一种；所述分子特异性标记引物序列为：

上游引物5′-ATCCGAAGCTCTTCAGTAAAC-3′

下游引物5′-TGCCGAAGTATATCAAG-3′。

所述方法关键在于扩增引物的选择，DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。

优选的，本发明所述PCR反应体系组成如下：

PCR Buffer                终浓度为1×

dNTPs                     1mmol/L

MgCl₂                     2.5mmol/L

Taq DNA酶                 2.5U

上、下游引物              各1.25μM

模板DNA                   60ng

余量为ddH₂O；

PCR反应条件如下：

94℃预变性6min后；92℃变性40s，52℃退火40s，72℃延伸2min，共30个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃。