[发明专利]肺炎克雷伯菌对β-内酰胺酶耐药基因检测方法

权利要求书

1、一种肺炎克雷伯菌对β-内酰胺酶耐药基因检测方法，包括以下步骤：

(1)、选择住院病人肺炎克雷伯菌菌株，全部菌株经细菌鉴定仪鉴定菌种后采样备用，

(2)、采用微量稀释法测定抗菌药物的敏感性，进行抗生素敏感性判断，

(3)、采用PCR法检测β-内酰胺酶耐药基因，并选取DNA阳性株进行测序分析，所述β-内酰胺酶耐药基因及相应引物序列为：

基因名称                引物序列

blaTEM                  P1：AGGAAGAGTATGATTCAACA

                        P2：CTCGTCGTTTGGTATGGC

blaSHV                  P1：TGCGCAAGCTGCTGACCAGC

                        P2：TTAGCG(T/C)TGCCAGTGCTCGA

blaLEN                  P1：ATGCGTT(A/T)T(A/G)TTCGCCTGTG

                        P2：GGCGCTCAGATGCTGCGC

blaOKP                  P1：A(A/G)GCGCTTCCCGGCGACGTG

                        P2：TTAGCG(T/C)TGCCAGTGCTCGA

blaCTX-M-1群            P1：ATGGTTAAAAAATCACTGCGC

                        P2：TCCCGACGGCTTTCCGCCTT

blaCTX-M-2群            P1：ATGATGACTCAGAGCATTCG

                        P2：TCCCGACGGCTTTCCGCCTT

blaCTX-M-9群            P1：CGGCCTGTATTTCGCTGTTG

                        P2：TCCCGACGGCTTTCCGCCTT

blaOXA-1群              P1：CTGTTGTTTGGGTTTCGCAAG

                        P2：CTTGGCTTTTATGCTTGATG

blaOXA-2群              P1：CAGGCGC(T/C)GTTCG(T/C)GATGAGTT

                        P2：GCC(T/C)TCTATCCAGTAATCGCC

blaOXA-10群             P1：GTCTTTC(A/G)AGTACGGCATTA

                        P2：GATTTTCTTAGCGGCAACTTA

blaPER                  P1：AGTCAGCGGCTTAGATA

                        P2：CGTATGAAAAGGACAATC

blaGES                  P1：ATGCGCTTCATTCACGCAC

                        P2：CTATTTGTCCGTGCTCAGG

blaVEB                  P1：GCGGTAATTTAACCAGA

                    P2：GCCTATGAGCCAGTGTT

blaDHA              P1：AACTTTCACAGGTGTGCTGGGT

                    P2：CCGTACGCATACTGGCTTTGC

blaACT-1            P1：TCGGTAAAGCCGATGTTGCGG

                    P2：CTTCCACTGCGGCTGCCAGTT。

2、如权利要求1所述的一种肺炎克雷伯菌对β-内酰胺酶耐药基因检测方法，其特征在于：所述的基因的检测中，各靶基因PCR扩增体系均为：每反应体系P₁、P₂引物各0.5μM，dNTPs200各mM，KCl 10mM，(NH₄)₂SO₄ 8mM，MgCl₂ 2mM，Tris-HCl pH9.0 10mM，NP₄₀ 0.5％，BSA 0.02％ wt/vol，Taq DNA pol 1U，总反应体积20μl，PCR扩增产物>500bp热循环参数均为：93℃预变性2min，然后93℃60s→55℃60s→72℃60s，循环35周期，最后一个72℃延长至5min，PCR扩增产物<500bp热循环参数均为：93℃预变性2min，然后93℃30s→55℃30s→72℃60s，循环35周期，最后一个72℃延长至5min，产物经1％琼脂糖凝胶电泳，出现与阳性对照分子相当的目的条带判为阳性。