[发明专利]肺炎克雷伯菌对β-内酰胺酶耐药基因检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因检测方法，尤其是涉及一种肺炎克雷伯菌对β-内酰胺酶耐药基因检测方法。

背景技术

抗菌药物发展的历史，是一部人类与细菌做斗争的历史。人类不断研制开发新药，细菌则通过改变自已的结构来与抗菌药物相对抗。抗菌药物的滥用致使耐药菌比例越来越大，耐药程度越来越高，新药研制的速度已远远不及细菌耐药性产生的速度。抗菌药物滥用是世界范围内存在的问题，我国尤为严重。据统计，我国住院病人中使用抗菌药物的比例占住院病人的60％-70％，在美国仅为20％。抗菌药物的滥用直接导致了耐药菌逐年增多，院内感染发生率不断上升。如果不加强规范、合理用药，一旦出现耐药菌感染性疾病爆发流行，将会出现无药可治的尴尬局面。因此，研究细菌耐药机制及其规律就显得十分紧迫和必要。

肺炎克雷伯菌广泛分布于自然界、健康人的皮肤、肠道和呼吸道。正常情况下，肺炎克雷伯菌并不感染人体的任何组织。老年病人免疫力低下，长期大量使用抗菌药物或创伤性医疗操作(如气管切开、尿道插管和肾透析等)等情况下易引起内源性感染。肺炎克雷伯菌所致感染中以呼吸道感染、泌尿道感染、菌血症等最为常见。肺炎克雷伯菌在临床标本的分离率为8.0％，其耐药率为6.1％-85.7％。近年来，从临床分离到的肺炎克雷伯菌可耐受多类抗菌药物：包括青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类、氯霉素、磺胺类药物等，出现了多重耐药菌株。为此，针对肺炎克雷伯菌分子耐药机制与感染关系进行深入研究，对了解本地区肺炎克雷伯菌的耐药基因流行状况、指导临床合理使用抗菌药物、研发新药的导向等具有重要意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种肺炎克雷伯菌对β-内酰胺酶耐药基因检测方法，旨在应用现代分子生物学技术和现代信息技术进行细菌耐药机制和耐药的相关基因研究，揭示肺炎克雷伯菌对β内酰胺类抗菌药物产生耐药原因，达到快速诊断细菌的耐药性的目的，明确本地区肺炎克雷伯菌耐药基因流行状况，为指导临床研究合理使用抗菌药物提供依据。

本发明为实现上述目的采取的技术方案如下，一种肺炎克雷伯菌对β-内酰胺酶耐药基因检测方法，包括以下步骤：

1、选择住院病人肺炎克雷伯菌菌株，全部菌株经细菌鉴定仪鉴定菌种后采样备用。

2、采用微量稀释法测定抗菌药物的敏感性，进行抗生素敏感性判断。

3、采用PCR法检测耐药基因，检查β-内酰胺酶耐药基因并选取DNA阳性株测序分析。

①、模板制备

挑纯培养菌落置入0.5ml离心管内(内预置200ng/ml蛋白酶K溶液200μl)，56℃水浴2小时，改95℃水浴10分钟，加入Chelex-10040μl，离心(15000rpm)30秒。上清液即为基因检测的模板液，-20℃冰箱保存备用。

②、基因的检测

采用聚合酶链反应(PCR)法，各种靶基因PCR扩增体系均为：每反应体系P₁、P₂引物各0.5μM，dNTPs200各mM，KCl 10mM，(NH₄)₂SO₄8mM，MgCl₂ 2mM，Tris-HCl(pH9.0)10mM，NP₄₀0.5％，BSA 0.02％(wt/vol)，Taq DNA pol 1U。总反应体积20μl(其中模板液5μl)。PCR扩增产物>500bp热循环参数均为：93℃预变性2min，然后93℃60s→55℃60s→72℃60s，循环35周期，最后一个72℃延长至5min。PCR扩增产物<500bp热循环参数均为：93℃预变性2min，然后93℃30s→55℃30s→72℃60s，循环35周期，最后一个72℃延长至5min。产物经1％琼脂糖凝胶电泳，出现与阳性对照分子相当的目的条带判为阳性。

优选地，选择以下β-内酰胺酶耐药基因TEM、SHV、LEN、OKP、CTX-M-1群、CTX-M-2群、CTX-M-9群、OXA-1群、OXA-2群、OXA-10群、PER、GES、VEB、DHA、ACT-1进行耐药性分析，相应的引物序列为：

P1：AGGAAGAGTATGATTCAACA

P2：CTCGTCGTTTGGTATGGC

P1：TGCGCAAGCTGCTGACCAGC

P2：TTAGCG(T/C)TGCCAGTGCTCGA