[发明专利]一种快速提取和纯化植物病组织中病原菌DNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及模板DNA的制备方法，更具体的说是一种快速提取和纯化植物病组织中病原菌DNA的方法。

背景技术

基因组DNA的提取是分子生物学研究的基础，DNA提取的质量和产量是直接影响PCR扩增的关键步骤，自PCR技术问世以来，这一技术已被广泛应用到生命科学的各检测领域。尤其是在植物病理学的发展研究中，对侵染植物组织的病原真菌或细菌的病原物种类鉴定、病菌的系统进化研究和病菌抗性分子检测等工作都离不开PCR技术，而开展上述这些工作的首要任务是从植物病组织中提取病原菌的基因组DNA。传统的方法是对植物病组织进行培养，分离并纯化病原菌，再对病原菌提取DNA进行进一步的研究。但是传统的方法耗时、繁琐，严重减慢了检测速度，并且在分离培养的过程中容易造成杂菌污染甚至分离不到真正的病原菌，对专性活体寄生的病原菌也不适用。同时，从植物病组织培养分离得到的病原菌只是代表该病组织的个体情况，而对病原菌群体分子检测等工作的开展带来困难。因此，不经过分离培养而直接从植物病组织中快速提取到高质量的病原菌DNA成为解决问题的关键。

目前关于DNA提取的方法，国内外已有很多报道。这些方法主要有SDS法，尿素提取法，CTAB提取法，SDS-CTAB提取法，氯化苄提取法。这些提取方法步骤大体相似，主要过程包括样本的收集、细胞壁的破碎、DNA的抽提、有机溶剂去蛋白质、DNA的沉淀和洗涤等。然而总体来说，这些方法比较耗时，流程繁琐，同时样品需要用多个离心管，容易造成功混淆和污染，而且操作时需要用一些大量有毒的有机溶剂(如酚、氯仿，CTAB等)，若操作和处理不当，会对实验人员的健康造成伤害。另外，许多公司开发了DNA提取试剂盒，试剂盒法虽然比较省时省力，但是价格比较昂贵，难以用于对大量样品的检测。然而，植物组织中还含有大量的酚和醌类物质以及碳水化合物等PCR反应抑制物，采用上述方法提取植物组织中的病原菌DNA对其DNA的质量和产量以及PCR检测的灵敏度都有一定的影响。

因此，建立一种省时省力、廉价、低污染的提取植物病组织中病原菌DNA的方法，将会对许多植物病理学的研究有很大帮助。

发明内容

本发明提供了一种改进的快速提取和纯化植物病组织中病原菌DNA的方法，克服了传统病原菌分离培养和DNA提取的步骤多、费时等缺点，具有简单、污染小、快速、经济、准确等优点。

一种快速提取和纯化植物病组织中病原菌DNA的方法，按如下步骤进行：

(1)取待测植物病组织样本，加入提取液(简称DEB)后进行研磨，充分研磨至组织完全破碎，再加入提取液，混匀后静置；

所述的待测植物病组织是指由真菌或细菌侵染引起的无明显病症或有明显病症的植物组织；

通常，研磨前加入的DEB可以将待测样本浸没即可，并无严格要求；

所述的DEB由聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、Tris-HCl、EDTA、NaCl、SDS和ddH₂O组成，pH为8.0；各组分的优选含量，以提取液总体积计：PVP：1-2g/100ml，Tris-HCl：200mM，EDTA：50mM，NaCl：20mM，SDS：1g/100ml，余量为ddH₂O；

所述的研磨时间最优应在1-2min，可采用将尖头玻棒安装在常用的电工手电转上进行研磨的方式，转速为1500-2500rpm/min，不需要液氮研磨等繁琐费力的过程，既避免了交叉污染又减少了原材料的需求量；并且采用此方法只需1-2min即可研磨完成；

(2)将步骤(1)所得混合液离心，分离得到上清液后加入等体积的无水乙醇，再次离心得到沉淀的DNA；两次离心的最优条件为4℃，转速12000-15000rpm；

(3)将沉淀的DNA用70％乙醇洗涤，干燥后溶于无菌水，即为提取的DNA；

(4)将提取的DNA溶液过柱纯化；

纯化采用UNIQ-10柱式PCR产物回收试剂盒(上海生工生产)，其组分包括：Binding Buffer，Washing Buffer，Elution Buffer和UNIQ-10柱。

本发明提供的一种快速便捷的提取和纯化植物病组织中病原菌DNA的方法，与现有的方法比较具有以下优点：

(1)本发明直接从植物病组织中提取病原菌DNA，省去了病原菌分离培养等繁琐的过程，大大提高了检测的效率和病原物群体检测的可信度；对一些没有明显病斑的植物组织的潜在病原菌和活体寄生菌的检测也有很好的作用；