[发明专利]PolyLyse-HSP70融合蛋白膜修饰的肠癌细胞瘤苗及其制备方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种可用于预防和治疗结直肠癌的聚赖氨酸-热休克蛋白70(PolyLyse-HSP70)融合蛋白膜修饰的肠癌细胞瘤苗及其制备方法。

(二)背景技术

肿瘤的生物治疗特别是免疫治疗是肿瘤综合治疗的重要内容。近年肿瘤临床免疫治疗获得重大进展：某些免疫制剂如赫赛汀、美罗华等单抗与化疗相结合可大幅度提高肿瘤治愈率和延长患者生存率。其机理是这些抗体激活宿主免疫细胞与抗体/补体依赖的细胞毒作用，促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤转移和提高肿瘤细胞对化疗药的敏感性。这些进展表明针对肿瘤细胞的抗体在机体抗肿瘤免疫、提高化疗药的敏感性上发挥重要作用。免疫治疗成为肿瘤治疗研究的重要方面，并出现与化疗结合形成化学-免疫治疗的趋势。

肿瘤细胞在突变过程中尤其经化疗后，存活的肿瘤细胞的细胞膜将产生和暴露出更多的抗原决定蔟并多以半抗原形式存在，结合载体后形成完全抗原，有可能产生有效的抗肿瘤抗体。这对抗肿瘤化学-免疫治疗具有重要意义。另一方面，已知细胞毒淋巴细胞(CTL)作用在抗肿瘤免疫中起重要作用。但诱导产生CTL的肿瘤抗原(CTL表位)在不同的肿瘤中却不同，且分离困难，不具备通用性；肿瘤的抗原调变也影响瘤苗的CTL作用。近年发现热休克蛋白(HSP)可通过独特机制诱导特异性抗肿瘤免疫。HSP瘤苗可较好地解决肿瘤抗原调变，不必分离肿瘤抗原即可诱导CTL，又无明显的毒副作用。此外，HSP本身具有免疫佐剂效应，应用性强。大量实验和临床治疗也证明了HSP瘤苗的诸多优越性。HSP抗肿瘤应用研究已成为研究热点。而HSP全细胞瘤苗因包含全部肿瘤抗原而成为重要研究内容。但是，目前的HSP全细胞瘤苗的抗肿瘤效应是基于HSP-抗原肽(诱导CTL的抗原成分)在瘤细胞裂解后释放的。这不利于HSP-抗原肽与抗原提呈细胞(APC)上的HSP受体结合，影响了其抗肿瘤效应。研究发现用基因工程方法使胞浆中的HSP70表达到肿瘤细胞表面，可促进抗肿瘤特异性和非特异性免疫；膜表达HSP70的瘤苗产生更强的抗肿瘤效应。

综合治疗是结直肠癌临床治疗的发展方向，化学-免疫治疗则具有独特优势。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种具有较强抗肿瘤效应的肠癌细胞瘤苗及其制备方法。

本发明采用的技术方案是：

一种聚赖氨酸-热休克蛋白70(PolyLyse-HSP70)融合蛋白膜修饰的肠癌细胞瘤苗，所述肠癌细胞瘤苗为跨膜表达PolyLyse-HSP70融合蛋白的CT26肠癌细胞的灭活细胞，所述融合蛋白的PolyLyse端嵌入肠癌细胞细胞膜、HSP70端游离在肠癌细胞膜之外；所述PolyLyse为长度为60--100个的多聚赖氨酸肽段。本发明要点在于以肠癌细胞跨膜表达融合蛋白的方式获得肠癌细胞瘤苗，将融合蛋白的PolyLyse端嵌入肠癌细胞细胞膜、HSP70端游离在肠癌细胞膜之外，在已知这一蛋白表达方式的前提下，本领域技术人员可根据常识进行基因序列的设计、载体的构建、细胞的基因修饰、阳性克隆筛选，方便地获得本发明所述的肠癌细胞瘤苗。

优选的，所述PolyLyse为长度为60个的多聚赖氨酸肽段。

为增加空间活动性，以免融合蛋白中PolyLyse与HSP70相互影响功能，所述PolyLyse肽段与HSP70之间可插入3～5个丙氨酸。

所述肠癌细胞瘤苗优选为跨膜表达PolyLyse-HSP70融合蛋白的CT26肠癌细胞的灭活细胞，因为跨膜表达PolyLyse-HSP70融合蛋白的CT26肠癌细胞瘤苗为所保藏的活细胞，而应用于作为瘤苗时必须经过灭活处理才可以。所述跨膜表达PolyLyse-HSP70融合蛋白的CT26肠癌细胞瘤苗活细胞，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏日期：2008年6月25日，保藏编号CCTCC NO：C200826。

本发明还涉及所述肠癌细胞瘤苗的制备方法，所述方法包括：以跨膜型融合基因修饰肠癌细胞，使肠癌细胞跨膜表达PolyLyse-HSP70融合蛋白，所述融合蛋白的PolyLyse端嵌入肠癌细胞细胞膜、HSP70端游离在肠癌细胞膜之外，筛选阳性克隆，灭活细胞，得到所述肠癌细胞瘤苗。