[发明专利]胶体金免疫层析法检测牛白血病抗体的试纸条及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种牛白血病病毒(BLV)囊膜糖蛋白gp51体外表达、分离纯 化，和胶体金免疫层析法检测牛白血病抗体的试纸条及其制备方法，属动物检 疫检测技术，主要应用于公共卫生领域。

背景技术

BLV检测方法主要有病毒直接检测、血清学方法、分子生物学方法以及其 他方法。目前已有的血清学方法主要有琼脂扩散试验(AGID)、间接免疫荧光 试验(IIFA)、补体结合试验(CFA)、放谢免疫试验(RIA)及酶联免疫吸附试 验(ELISA)等。但琼脂扩散试验检测周期稍长，一般需要一到两天的时间， 而ELISA方法检测速度相对来说较快(需要数小时)，目前使用的检测试剂盒 为美国IDEXX公司生产，但是其价格昂贵，普及使用受到极大的影响，而且需 要酶标仪等仪器设备。BLV感染最常用的检测方法就是血清学方法，虽然这些 方法操作简单，能有效地检测BLV的感染，防止其流行，然而这些方法也存在 着某些不可弥补的局限性，如①在病毒早期阶段不能测出抗体，不能检出早期 感染；②易出现非特异性反应，产生假阳性结果；③由于新生小牛能从母乳中 获得抗体，因此血清学方法不能被动免疫或主动免疫；④检测所需时间较长； ⑤检测费用昂贵等。另外，不同的血清学方法检测BLV阳性血清，其敏感程度 也不一样。Monti GE等(2005)在研究实验性感染BLV牛阳性血清转变时间时 发现，AGID比ELISA检出时间要早，但Reichel等(1998)发现ELISA试验比 AGID和电泳免疫印迹(EIB)敏感性提高10％，多检出约10％的反应血清。即使 同一种检测方法，其敏感程度也不一样，MPRidge SE等(2005)通过比较发现， 在目前较灵敏的Lactelisa ELISA法可检测稀释200倍奶样中BLV抗体。 Antonio DG等(2004)利用重组杆状病毒表达了BLV gp51，并用该表达的gp51 研制出检测BLV阳性血清的ELISA检测方法，该方法与传统的BLV ELISA检测 方法相比，符合率为99％，与AGID相比，符合率为100％，且将标准阳性血清 稀释1600倍时，检测结果仍显示强阳性，而这两种ELISA方法都会增加假阳 性的几率。免疫胶体金快速诊断技术是目前较常使用的一项技术，且有逐渐取 代ELISA的等检测方法的趋势。随着胶体金免疫层析技术的逐步完善，譬如可 以对一个样品进行多项检测，以及可以定量检测等，使其更易得到市场的青睐。 而免疫胶体金快速诊断技术的无污染、便捷、灵敏、安全，不仅更适合于未来 环保型社会，而且利于野外检测，有着相当大的应用前景。其优点具体表现在 以下几方面：①快捷迅速，大大缩短出结果时间。出结果的时间都在几分钟之 内，这是目前其它快速检测方法所无法达到的，如市场上销售的金标hCG快速 检测纸条一般1-2min内就能出结果，这种快速与胶体金本身显色特点有关， 也与免疫层析法以及“免疫浓缩”有关，而其他如ELISA法出结果要1-2h；PCR 步骤繁琐，耗时甚长。②灵敏准确，结果受外因影响较少。免疫胶体金快速诊 断方法并不因为其快速而牺牲了它的灵敏准确性。如用GICA试纸条检测HBsAg 标准品，灵敏度可达1ng/ml。用GICA与酶免疫法比较检测了395份不同血清 标本中HBsAg，两法符合率为99.0％。此外，由于胶体金标记蛋白质是一物理 结合过程，结合牢固，很少引起蛋白质活性改变，所以试剂非常稳定，不受温 度等外界因素影响，可在实验室，甚至野外进行检测，实验结果也可长期保存。 ③安全简便，不需任何仪器和设备。免疫胶体金检测方法不需任何仪器和设备， 只需制备好的试纸条或试剂盒即可，由于胶体金本身具有颜色，比ELISA省略 了加显示剂和终止液的步骤，大大简化了操作，更适合于野外临床的现场应用。 因为没有诸如放射性同位素、邻苯二胺等有害物质参与，所以也不会污染环境， 具有放射性同位素或酶标等检测方法所无法比拟的安全性。④成本低廉，所需 试剂和样本量少。因为“免疫浓缩”效应存在，免疫胶体金实验所需试剂和样 本量都非常少，样本量可低至1-2ul，再加上无需任何仪器和设备，并且可单 份标本检测，使成本大幅下降。目前国内外尚无将胶体金诊断试纸应用到检测 BLV感染方面的报道。

发明内容