[发明专利]含微粉化重组人血管内皮抑制素缓释微球的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及重组人血管内皮抑制素缓释微球的制备方法，尤其涉及一种具有高包封 率的重组人血管内皮抑制素缓释微球的制备方法。

背景技术

20世纪60年代，美国哈佛医学院的Folkman博士提出“肿瘤生长依赖血管生长”这 一假设，并于1971年提出“饿死肿瘤疗法”理论。今天，在分子生物学技术的推动下， 运用基因工程技术研发出了抗癌蛋白质-恩度。中国专利CN 1237072C罗永章等在天 然Endostatin的N末端添加了9个氨基酸，不仅使Endostatin稳定性提高，半衰期延长， 而且生物活性增加，蛋白的复性率也高于一般生产方法。该药物已正式上市，命名为恩 度，其活性成份为一基因工程蛋白——重组人血管内皮抑制素Endostar，Endostar是以 重组DNA技术生产，以大肠杆菌为表达系统，其表达出的Endostar与先前的Endostatin 相比较，表达水平更高，疗效更强。它通过阻断肿瘤新生血管生成，从而阻断肿瘤的营 养供给，逐步减小肿瘤体积，达到抗肿瘤作用。所生产的重组人内皮抑制素由192个氨 基酸构成，其氨基酸序列为：

(M)GGSHHHHHHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGL AGTFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGSEGPLKPGARIF SFDGKDVLRHPTWPQKSVWHGSDPNGRRLTESYCETWRTEAPSATGQASSLLGGRLL GQSAASCHHAYIVLCIENSFMTASK，其中当由大肠杆菌表达时其N末端的Met有时 会被部分删除。

蛋白与多肽在很多治疗方面都是理想的药物，然而这些有益的效用最终可能受限于 传递蛋白的困难。在口服和透皮给药中，其生物利用度通常很低，并且半衰期短。将蛋 白和多肽类药物制备成微球制剂可以减少注射频率，提高患者的顺应性。对蛋白和多肽 类药物，微球是相当理想的载药系统。目前有多种蛋白、多肽类药物的缓控释微球处于 研发阶段，包括促黄体生成素释放激素拮抗物(LXT-101)，重组人胰岛素样生长激素 (rhIGF-I)以及干扰素α2-b(IFNα2-b)等。此外，一些微球制剂已获FDA批准应用于临床， 如日本Takeda公司的亮丙瑞林微球Lupron Depot，瑞士Debiopharm公司的曲普瑞林微 球Trelstar Depot和瑞士Novartis公司的奥曲肽微球Sandostatin Depot等。

微球是指药物溶解或分散在高分子材料基质中形成的微小球状实体，属于基质型骨 架微粒。微球的粒径通常在1μm-300μm之间，药物被制成微球制剂后，有着靶向性、缓 释性、安全性等特点。有多种材料可制备微球，近年来可生物降解高分子材料作为微球 的基质受到了越来越多的重视，并广泛应用于医学领域的研究。乳酸-羟基乙酸共聚物 (poly lactide-co-glycolide，PLGA)是一种生物相容性良好的可降解高分子材料，其主链 含有不稳定的酯键，在体内降解后的终产物为水和二氧化碳。并获FDA批准作为医用材 料。

生物技术的革新和发展使重组蛋白和多肽药物得以实现大规模的生产和应用。蛋白 与多肽在水溶液中不稳定，易失活，溶液状态的蛋白在微球的制备工艺中(高剪切、温 度、有机溶剂)易失活。例如将蛋白溶液与有机溶剂接触后，由于油水界面表面张力的 存在，使蛋白构象改变而失活。现有的在蛋白原液中直接添加冻干保护剂的冷冻干燥法 也可得到干燥的固态蛋白，但得到的蛋白颗粒大，辅料占的比重大，多用于制成冻干粉 针剂，用途不广泛。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种重组人血管内皮抑制素载药量 高、突释量合适且缓释周期较长的缓释微球制剂的制备方法。本发明的目的是通过下列 技术措施实现的：

含重组人血管内皮抑制素微粉缓释微球的制备方法，其特征在于：

(1)将乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于有机溶剂中得到内油相

(2)再将重组人血管内皮抑制素微粉加入内油相；

(3)以每分钟4000-50000转高速分散重组人血管内皮抑制素微粉及内油相，得到 固液混悬液；

(4)将所得混悬液置于盛有含乳化剂的植物油或矿物油的搅拌容器中，在0～60℃ 和每分钟100～2000转的速度搅拌形成油包油包固型复乳；