[发明专利]无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒及无机磷(磷酸根)浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定无机磷(磷酸根)浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。

背景技术

人体内磷的87％都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持动态平衡，血中钙、磷浓度之间有一定关系，正常人血钙升高则血磷降低，反之亦然。血浆中[钙]、[磷]浓度的乘积保持在一定范围；大约每100毫升血浆钙磷浓度的乘积为35-40。当二者乘积大于40时，钙和磷以骨盐形式沉积在骨组织，＞70时，可发生转移性钙化。当乘积＜35时，则将妨碍骨组织的钙化，甚至使骨盐再溶解，影响成骨作用，引起佝偻病或软骨病。血浆[Ca]、[Pi]的恒定，主要受维生素D，甲状旁腺激素及降钙素的调节。

由于人体的磷目前还不能直接测定，所以无机磷的检测实际上是分析磷酸盐阴离子(H₂PO₄^1-，HPO₄^2-)。常用的方法有磷钼酸还原法，非还原法，染料结合法，酶法，同位素稀释质谱法、原子吸收分光光度法和流动注射分析法等。决定性方法是同位素稀释质谱法，WHO推荐的中等实验室测定无机磷的常规方法是比色法。

磷钼酸还原法又有无蛋白学滤液法和不去蛋白法，后者需在试剂中加入非离子型表面活性剂以避免混浊。所用还原剂和表面活性剂种类很多，性能比较稳定的还原剂有硫酸亚铁，硫酸亚铁铵，硫酸肼，米吐尔等。表面活性剂则以聚乙二醇基苯基醚(TritonX-100)最理想。

磷钼酸非还原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接测定磷钼酸杂聚化合物，方法简便，便于自动化。但黄疸，溶血，脂浊血清在340nm有光吸收，必须做标本空白，否则结果偏高。

酶法测定无机磷是发展趋势，其优点是无机磷酸盐化合物在酶作用下的中性范围内是稳定的，可用于常规样品的自动化分析。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶循环扩增法(EnzymaticRecycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定无机磷(磷酸根)浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行无机磷(磷酸根)浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明无机磷(磷酸根)浓度测定方法原理如下：

磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸  丙酮酸羧化酶  腺苷三磷酸+

                                        丙酮酸+二氧化碳

二氧化碳+乙酰磷酸+过氧化氢  丙酮酸氧化酶  磷酸根+

                                        丙酮酸+氧+水

丙酮酸+精氨酸+还原型辅酶  章鱼碱脱氢酶

                       N2-(D-1-羧乙基)-L-精氨酸+辅酶+水

这种方法应用丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase；EC 6.4.1.1)酶(偶)联丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase；EC 1.2.3.3)、章鱼碱脱氢酶(Octopine dehydrogenase；EC 1.5.1.11)酶促反应连续监测法。丙酮酸羧化酶作为作用酶，功能为将无机磷(磷酸根)酶解产生二氧化碳。丙酮酸氧化酶作为循环酶：丙酮酸氧化酶的酶促作用使二氧化碳再次变回无机磷(磷酸根)，使无机磷(磷酸根)不断地被重复循环利用，从而不断地产生丙酮酸。章鱼碱脱氢酶作为显色酶，将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为氧化型辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算无机磷(磷酸根)的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒较为理想：

缓冲液                100mmol/L