[发明专利]一种基因免疫方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种基因免疫方法。

背景技术

随着功能基因组学的发展，很多新的功能基因被确定并克隆，为了进一步研究新基因在组织或细胞内的定位，及蛋白质间联系等生物学特性，则必须应用特异性抗体。常规的抗体的制备主要涉及到蛋白质的纯化及免疫，但是有些蛋白却很难通过蛋白免疫法获得抗体，主要是有以下几种原因造成如：一些膜结合蛋白很难纯化；有的蛋白质纯化后的产量很低，不足以制备抗体；一些原核表达蛋白缺少翻译后修饰，引起错误折叠，以此抗原制备的抗体，一般均不能识别出天然的抗原；整个蛋白质的纯化过程耗时，耗力且费用较大。随着功能基因组学的发展，一种新的利用cDNA作为免疫抗原来制备相应抗体的技术---基因免疫应时而生。

基因免疫是指把外源基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组质粒DNA直接注射到动物体内，使外源基因通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，激活机体的免疫系统，引发免疫反应的过程。基因免疫的发现和研究始于1990年，由美国威斯康星大学的Wolff等发现，对小鼠直接肌肉注射纯化的DNA重组表达载体，其外源基因能在小鼠骨骼肌细胞内表达，并发现该基因编码的蛋白子在60天后仍具有生物学活性，而且没有检测出外源基因与宿主染色体整合。Ulmer等证实，给小鼠肌肉注射编码甲型流感病毒核蛋白的载体质粒后，可有效地保护小鼠抵抗另一亚型流感病毒的攻击。随后的大量动物实验研究表明，编码目的抗原基因的合适质粒通过肌肉注射的方法接种后，既能诱导动物机体产生体液免疫应答，又能引起细胞免疫应答，保护机体免受同源病原体的侵害。于是，基因免疫技术应运而生，概念深入人心，但此后的一系列肌肉直接注射法，所制备的抗体效价均不理想。虽然Sundaram等用粒子介导的基因枪注射法进行基因免疫获得的抗体效价较高，但是此种方法花费较大，而且需要对动物进行麻醉和脱毛等复杂过程。

“睡美人(Sleeping Beauty，SB)”转座系统属于Tc1/mariner转座子家族，由转座子质粒和转座酶组成，其转座酶已失活了一千多万年。1997年Ivics等根据积累的系统发生数据，利用生物信息学的方法，对其进行分子重建，终于唤醒了其转座活性。

睡美人转座酶是II型转座子系统中的重要成分，其作用主要是促进转座元件的转移。Masuda等研究发现，将一组不含转座子序列的表达荧光素酶的质粒与转座酶质粒协同注射，另一组只注射表达荧光素酶的质粒。结果发现前者比后者荧光素酶的表达水平提高了5倍，表明转座酶本身就可以增强外源基因的表达，与转座子的存在与否无关，但荧光素酶基因均没有整合到染色体中。因此转座酶不仅可以促进转座的发生，其本身还可以促进基因的表达，因此可以作为基因免疫的佐剂，提高抗体效价，目前转座酶在基因免疫应用上的研究尚未见报道。

基于以上观点，本发明人以家兔为实验动物，经过大量基础研究工作，终于完成了本发明。

发明内容

本发明的目的在于建立一种简单、高效、实用的基因免疫方法。

本发明的技术方案是：一种基因免疫方法，是：以常规方法克隆目标基因cDNA，然后构建含目标抗原cDNA的真核表达载体重组质粒，以转座酶质粒作为免疫佐剂；将真核表达载体重组质粒和转座酶质粒按4∶1混匀，然后用基因包裹剂PEI按PEI∶质粒＝2∶1包裹，按每克体重注射1微克质粒的剂量为进行动物免疫。

上述方法中，PEI的使用浓度优选为10毫克/毫升。所说的动物包括但不限于兔。所说的注射，优选后肢内侧肌肉多点注射方法。

更具体的方案，包括以下步骤：

(1)克隆目标基因cDNA：以常规方法制备含目标基因RNA的总RNA，反转录成为第一链cDNA，进行聚合酶链反应(PCR)扩增，扩增出的目的片段，然后克隆入TA载体，并进行测序鉴定；

(2)真核表达载体构建：将目标cDNA亚克隆入改造过的pcDNA3.0(pA)载体中(用PvuII切除其中的neo基因及其表达调控序列)，或其它含CMV启动子的真核表达载体。

(3)免疫程序：用按常规碱裂解法大规模提取睡美人转座酶质粒和所构建的重组质粒，纯化后HBS溶解，得到2μg/uL的溶液，将已经制备的重组质粒和转座酶质粒按4∶1混匀，用基因包裹剂PEI按(PEI∶plasmids＝2∶1)包裹后，37℃温育10分钟备用；

取家兔，以上混合物多点注射后肢内侧肌肉，每两周注射一次，注射剂量为每克体重注射重组质粒1μg，PEI与转座酶质粒按比例混合，共注射三次，在第18周加强免疫一次。