[发明专利]基于靶蛋白亲和选择的活性成分高通量筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及高通量筛选领域，具体涉及一种基于靶蛋白亲和选择的活性成分或活性成分 群的高通量筛选方法，为一种利用多维色谱-质谱联用筛选对靶蛋白具有高亲和力的活性成分 特别是活性成分群的方法。

背景技术

在创新药物研究过程中，发现具有生物活性的先导化合物(Lead Compounds)是全部研 究工作的基础。目前，先导化合物的筛选大多采用动物、器官(组织)和细胞水平的筛选模 型，虽然从中筛选到一些有效药物，但是这种方法的筛选费用较高、所需化合物样品量大、 费时费力、实验周期长，因此不适用于含量较低的天然产物的筛选，更不适合进行大规模、 高通量的筛选。

随着后基因时代的到来，人们对疾病过程有了更深刻的认识，明确了越来越多的生物大 分子(如酶、受体、离子通道等)在生理、病理过程中的关键作用，而分子生物学技术的成 熟又为蛋白质分子在人体外表达提供了工具。应用基因重组技术将与疾病相关的重要酶、受 体等蛋白在合适的表达系统中表达，从而可以建立以分子为靶向的分子或细胞水平的高通量、 超高通量筛选模型(参见：Broach J.R.，Thoner J.High-throughput screening for drug discovery. Nature，1996，384：14；Landro J.A.，Taylor I.C.，Stirtan W.G，et al.HTS in the new millennium： the role of pharmacology and flexibility.JPharmacol Toxicol Methods，2000，44：273-289；陈苏 红，王华，王升启.基于细胞功能的超高通量筛选在化学基因组学药物发现中的应用.国外医 学药学分册，2002，29：345-348等)。虽然这种高通量筛选技术以其快速、高效等优势发展成为 现代新药发现过程中的三项主要技术之一，但该技术无分离过程和化合物鉴定功能，因此只 适用于结构已知的单体化合物(群)的筛选，在应用于天然产物提取物，特别是中药提取物 等复杂体系时往往会由于各类成分之间的相互干扰而得出一些假阴性或假阳性结果(参见： Bogustavasky J.HTS assay development：Is smaller really better Drug Discov.Dev.，2004，7： 37-40)。

生物色谱法是一种可以考察化合物复杂体系(如中药提取物)对酶、受体、细胞膜等结 合情况的一种较新的方法，该方法是以硅胶或凝胶为载体，其上涂敷或键合上活性酶、受体 或细胞膜等制备成色谱固定相，根据药物与酶、受体或细胞膜的相互作用的强弱不同将不同 的成分分离开来，但该方法在实际使用中存在诸多遗憾。例如：1、酶、受体或细胞膜与硅胶 等载体结合后其生物学特征会受到一定的影响。2、该方法对色谱流动相有着严格的限制，即 只能以生理缓冲液或极低浓度的有机溶剂作为流动相，否则会破坏生物大分子，这样使色谱 利用不同流动相而实现不同性质的化合物的分离的特点难以发挥，化合物在生物色谱上难以 实现彼此的相互分离。在“毛希琴等，三种色谱模式联用在中药活性成分初步筛选中的应用， 分析化学，2003，31(8)：992-995”的文献中，有川芎在模拟生物膜色谱柱、蛋白色谱柱和 反相柱上的分离图谱，显而易见生物膜色谱的分离效能不理想，不如反相色谱柱。3、生物色 谱的制备程序因为增加了硅胶介质与酶、受体或细胞膜等的结合过程，过程复杂，条件严格， 成本较高，如市售的蛋白柱高达上万元一个。4、因为所用的流动相是缓冲液，提供的图谱对 化合物的分离效果不好且不能与LC-MS在线联用，不能给出化合物的结构信息。(参见：孔 亮等，以人血清白蛋白为固定相的分子生物色谱分子几种中药活性成分的研究，高等学校化 学学报，2000，21：36。贺浪冲等，固定在硅胶表面细胞膜的酶活性及其色谱特性，科学通 报，1999(6)：633-637。赵小娟等，淫阳藿根与叶活性成分的分析和比较，分析化学，2002， 30(2)：195-197。高琨等，用细胞膜色谱法筛选研究红毛七中的有效成分，中国药学杂志， 2003(1)：14-16。)

发明内容