[发明专利]皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途

权利要求书

1、一种低免疫原性皮肤组织工程种子细胞的构建方法，其特征在于，包括：

培养人皮肤成纤维细胞并构建含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因腺病毒载体；

所述含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因腺病毒载体体外转染所述人皮肤成纤维细胞。

2、根据权利要求1所述的低免疫原性皮肤组织工程种子细胞的构建方法，其特征在于，所述培养人皮肤成纤维细胞具体为：将人皮肤成纤维细胞采用酶消化法将组织消化散开，制备成单个细胞悬液，按5×10³个/厘米²细胞密度接种于培养瓶中，置于温度为37℃、含有体积百分比为5％CO₂细胞培养箱中以含有重量百分比为10％胎牛血清的DMEM细胞培养液进行培养，当细胞生长至80％融合时进行传代、扩增。

3、根据权利要求1所述的低免疫原性皮肤组织工程种子细胞的构建方法，其特征在于，所述构建含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因腺病毒载体具体为：

构建CTLA4Ig融合蛋白表达载体；

构建CD40Ig融合蛋白表达载体；

构建CTLA4Ig和CD40Ig双基因克隆载体；

构建pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒；

构建含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体。

4、根据权利要求3所述的低免疫原性皮肤组织工程种子细胞的构建方法，其特征在于，所述构建CTLA4Ig融合蛋白表达载体具体为：

分离、活化人外周血单个核细胞；

提取、鉴定所述人外周血单个核细胞的RNA；

设计引物，第一引物包括CTLA-4基因胞外区N末端7个氨基酸残基和抑瘤素M信号肽C端15个氨基酸残基，第二引物对应CTLA-4基因119-125位氨基酸残基，并引入Bc1I酶切位点，第三引物包括抑瘤素M信号肽其余氨基酸残基并与第一引物的抑瘤素M信号肽部分重叠，在第三引物的5’端引入HindIII酶切位点；

反转录所述人外周血单个核细胞的RNA合成CTLA-4基因胞外区cDNA第一链，以CTLA-4基因胞外区cDNA第一链为模板，采用第一引物和第二引物进行第一轮扩增，以第一轮扩增的反应产物为模板，采用第二引物和第三引物进行第二轮扩增，用2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物；

构建pUC19-CTLA4融合质粒；

用HindIII和Bc1I双酶切所述pUC19-CTLA4融合质粒后，与经HindIII和Bc1I双酶切pX/Ig载体片段混合并连接，用连接后的产物再转化MC1061感受态菌，得到含有质粒pUC19的CTLA4Ig融合蛋白表达载体，用HindIII和XbaI酶切鉴定阳性转化克隆插入的片段长度；

测定所述阳性转化克隆插入的片段的序列。

5、根据权利要求3所述的低免疫原性皮肤组织工程种子细胞的构建方法，其特征在于，所述构建CD40Ig融合蛋白表达载体具体为：

分离、活化人外周血单个核细胞；

提取所述人外周血单个核细胞的RNA，并反转录为CD40基因胞外区cDNA；

用特异性引物扩增所述CD40基因胞外区cDNA，将扩增产物克隆到T载体上；所述特异性引物为第四引物：5’-CGTCCTCGAGCCACCATGGTTCGTCTGCCTC-3’，第五引物：5’-GCGATGATCAGATCTCAGCCGATCCTGGG-3’；

用HindIII和Bc1I双酶切pX/Ig载体，将回收的Ig基因的序列与克隆到T载体上的CD40基因的序列连接，得到CD40Ig融合蛋白表达载体。