[发明专利]皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，特别是指皮肤损伤创面修复过程中应用的低免疫原性皮肤组织工程种子细胞及构建方法、腺病毒载体及用途。

背景技术

皮肤是覆盖和保护体表的重要组织器官。由于各种原因造成的皮肤损伤都需要进行及时的修复。对于这种缺损的修复常规多采用自体皮肤移植的方法，但是这种方法不仅造成供皮区新的组织缺损，而且还经常受到供皮区来源的限制。

近年来利用组织工程技术制作组织工程皮肤已成为皮肤缺损移植治疗的热点。组织工程皮肤一般是在体外将种子细胞接种到支架材料上，在体外进行培养形成含有活细胞的皮肤样结构，然后用于临床使用。所用的种子细胞可来源于自体，也可来源于异体。自体细胞由于需要在体外经过相当长时间的培养扩增，容易延误治疗时间，因此目前组织工程皮肤的种子细胞一般来源于异体包皮环切术或手术中废弃的皮肤分离出来的表皮细胞和成纤维细胞。异体来源的种子细胞可以事先在体外进行大规模的扩增，这样就缩短了患者等待自体细胞扩增的时间，为组织工程皮肤的商品化提供了重要的条件。但是异体来源的种子细胞也存在不足：异体来源的种子细胞始终存在免疫原性，移植到患者后不可避免的存在免疫排斥反应，严重影响使用效果。

皮肤移植的免疫排斥反应是典型的细胞性排斥反应，活化的T细胞在皮肤移植排斥反应中起着决定性作用。而近几年的研究表明，T细胞必须在TCR/MHC识别及辅助刺激信号的共同作用下才能完全活化，起到排斥作用；而阻断辅助刺激信号，将会引起T细胞的无反应或细胞凋亡(apoptosis)，抑制排斥作用的发生。迄今为止已发现多种辅助刺激信号系统，如B7/CD28-CTLA4系统，CD40/CD40L系统，CD95(Fas)/FasL系统等，而作为皮肤组织工程的种子细胞---人皮肤成纤维细胞中含有免疫抑制基因CTLA4Ig和/或CD40Ig(包括利用病毒载体、非病毒载体、转基因等各种细胞修饰技术实现人皮肤成纤维细胞含有CTLA4Ig和/或CD40Ig基因，或者实现人皮肤成纤维细胞表达CTLA4Ig和/或CD40Ig蛋白)，因此如何通过CTLA4Ig和CD40Ig基因的表达来阻断T细胞的活化信号通道，并抑制免疫排斥的发生是需要解决的难题。

发明内容

本发明的目的是提供一种低免疫原性皮肤组织工程种子细胞及其构建方法，有效解决现有异体来源的种子细胞移植后存在免疫排斥反应的缺陷。

为实现上述目的，本发明提供了一种低免疫原性皮肤组织工程种子细胞的构建方法，包括：

培养人皮肤成纤维细胞并构建含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因腺病毒载体；

所述含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因腺病毒载体体外转染所述人皮肤成纤维细胞。

所述培养人皮肤成纤维细胞具体为：将人皮肤成纤维细胞采用酶消化法将组织消化散开，制备成单个细胞悬液，按5×10³个/厘米²细胞密度接种于培养瓶中，置于温度为37℃、含有体积百分比为5％CO₂细胞培养箱中以含有重量百分比为10％胎牛血清的DMEM细胞培养液进行培养，当细胞生长至80％融合时进行传代、扩增。

所述构建含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因腺病毒载体具体为：

构建CTLA4Ig融合蛋白表达载体；

构建CD40Ig融合蛋白表达载体；

构建CTLA4Ig和CD40Ig双基因克隆载体；

构建pDC316-CTLA4Ig-CD40Ig质粒；

构建含有CTLA4Ig-CD40Ig双基因Ad5F35腺病毒载体。

所述构建CTLA4Ig融合蛋白表达载体具体为：

分离、活化人外周血单个核细胞；

提取、鉴定所述人外周血单个核细胞的RNA；

设计引物，第一引物包括CTLA-4基因胞外区N末端7个氨基酸残基和抑瘤素M信号肽C端15个氨基酸残基，第二引物对应CTLA-4基因119-125位氨基酸残基，并引入BclI酶切位点，第三引物包括抑瘤素M信号肽其余氨基酸残基并与第一引物的抑瘤素M信号肽部分重叠，在第三引物的5’端引入HindIII酶切位点；

反转录所述人外周血单个核细胞的RNA合成CTLA-4基因胞外区cDNA第一链，以CTLA-4基因胞外区cDNA第一链为模板，采用第一引物和第二引物进行第一轮扩增，以第一轮扩增的反应产物为模板，采用第二引物和第三引物进行第二轮扩增，用2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物；

构建pUC19-CTLA4融合质粒；