[发明专利]一种筛选适用于检测和纯化凝血第八因子的单克隆抗体的方法

权利要求书

1.一种筛选适用于检测凝血第八因子的单克隆抗体的方法，其特征在 于，包含以下步骤：

a.分别用全长凝血第八因子和B区缺失的凝血第八因子免疫动物， 用酶联免疫吸附法筛选抗凝血第八因子呈阳性的单克隆抗体；

b.用蛋白印记方法从以全长凝血第八因子免疫动物产生的阳性单克 隆抗体中筛选出抗B区的抗体，从以B区缺失的凝血第八因子免疫动物产 生的阳性单克隆抗体中筛选出抗A1+A2区的抗体；

c.分别选择抗A1+A2区的单克隆抗体，以及抗A1+A2区的单克隆 抗体和抗B区的单克隆抗体的混合抗体作为一抗包酶标板用于ELISA检 测，分别对不同浓度的凝血第八因子标准品进行测定，绘制浓度曲线，计 算回归方程式和线性回归系数，挑选出线性回归最好的抗体，即为适用于 检测凝血第八因子的单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的筛选适用于检测凝血第八因子的单克隆抗 体的方法，其特征在于：所述的全长凝血第八因子和B区缺失的凝血第八 因子均为基因重组凝血第八因子。

3.一种检测凝血第八因子的试剂盒，其特征在于：采用权利要求1或 2筛选的适用于检测凝血第八因子的单克隆抗体作为一抗包板。

4.一种筛选适用于凝血第八因子分离纯化的单克隆抗体的方法，其特 征在于，包括如下步骤：

A.用B区缺失的凝血第八因子免疫动物，筛选抗A1+A2区的单克隆 抗体；

B.用免疫沉淀方法和凝血第八因子凝血活性检测，以凝血第八因子作 为抗原，对步骤A中筛选出的抗A1+A2区的单克隆抗体进行检测，筛选 出能在低浓度盐和低浓度乙二醇环境下与凝血第八因子结合的单克隆抗 体，所述的低浓度盐为0.5M氯化钠，低浓度乙二醇的浓度为5wt％；

C.对步骤B筛选出的单克隆抗体进行进一步筛选，在免疫沉淀实验 过程中提高反应的盐浓度，所述的盐浓度是1.5M氯化钠，筛选出在盐浓 度提高时与凝血第八因子结合力增强的单克隆抗体；

D.对步骤C筛选出的单克隆抗体进行进一步筛选，在免疫沉淀实验 过程中在提高反应的盐浓度的同时提高乙二醇的浓度，所述的乙二醇的浓 度是40wt％，并与未提高乙二醇的浓度时的数据相比较，筛选出在提高乙 二醇的浓度时结合力降低的单克隆抗体。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤A中，所述B区 缺失的凝血第八因子为基因重组凝血第八因子。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤B中，所述的凝血 第八因子是血浆来源凝血第八因子或基因重组凝血第八因子。

7.采用权利要求4筛选的适用于凝血第八因子分离纯化的单克隆抗 体制备的用于纯化凝血第八因子的抗体亲和层析柱。