[发明专利]一种筛选适用于检测和纯化凝血第八因子的单克隆抗体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，本发明是一种筛选适用于检测 和纯化凝血第八因子的单克隆抗体的方法。

背景技术

甲型血友病是一种先天性由凝血第八因子缺乏引起的出血性疾病。甲 型血友病最有效的治疗方法是输入正常人血浆、血浆来源的浓缩人凝血第 八因子制剂或基因重组来源的凝血第八因子制剂。在血浆来源的浓缩人凝 血第八因子制剂的生产过程中，凝血第八因子蛋白(即凝血第八因子抗原) 是无法被检测的，其原因是没有抗原检测的手段。因此，国内血源凝血第 八因子只是以活性标示，没有比活数据，即单位抗原所具有的凝血活性数 据。而且，由于不能检测凝血第八因子抗原，在从血浆中分离纯化凝血第 八因子的生产过程中只能监测凝血活性而不能监测凝血第八因子抗原的 量的变化，以至于生产过程中出现八因子失活情况也无法被发现。目前国 外已经有用酶联免疫吸附法检测凝血第八因子的试剂盒，我国还没有此类 八因子抗原的检测试剂盒，只能依赖进口。

通过对进口试剂盒的测试发现，虽然进口试剂盒的检测灵敏度非常 高，可以达到10ng/ml，但是用试剂盒提供标准品所得到的标准曲线线性区 域非常短，以至于影响了样品的检测。另外，在应用过程中还发现对于血 浆来源的凝血第八因子检测常常出现偏差较大、重复性差等情况，经分析 很可能是由于血浆来源凝血第八因子B区降解产物不均一所引起。图1A 显示的是凝血第八因子重链的示意图，最初的重链是由A1+A2+B三部分 组成，但随着蛋白分子的成熟，B区逐步被降解，使重链成为一个由A1+A2 部分和不同长度的B区所组成的混合物；图1B显示的是凝血第八因子的 蛋白印记试验，从图中可以看出凝血第八因子A1+A2呈现一条约90kDa 的蛋白条带，而在其上方是一片从100kDa到200kDa大小不等的A1+A2+B 条带。用进口试剂检测血液来源的凝血第八因子所发现的偏差较大、重复 性差等问题很可能是由于在这些检测试剂盒的抗体中有抗凝血第八因子B 区的抗体，由于血液来源的凝血第八因子B区的多样性导致抗体不能与B 区充分结合而造成偏差。

凝血第八因子的分离纯化也必须用到抗凝血第八因子的抗体。现在已 经有许多国外厂家用抗凝血第八因子的抗体所制成的亲和层析柱来分离 纯化血浆来源和基因重组来源的凝血第八因子。我国目前还没有用亲和层 析方法生产的高纯度血液来源的凝血第八因子上市，国内基因重组来源的 凝血第八因子也是一项空白。这项技术的难点主要在于凝血第八因子的不 稳定性使得抗体与凝血第八因子结合后很难通过某种洗脱方式解离并释 放出有生物学活性的凝血第八因子。国外厂家筛选到的适用于凝血第八因 子的抗体亲和层析柱的抗体应用SPR生物传感器方法将纯化的凝血第八 因子固定于生物芯片上，再加入被检测的单克隆抗体与凝血第八因子抗原 结合，然后用不同的条件洗脱并记录抗体解离的情况。由于生物芯片价格 昂贵，使用这种方法筛选抗体成本比较高，而且由于血液来源的凝血第八 因子纯度差，不适于用作结合在生物芯片的抗原，无法用SPR生物传感器 方法筛选抗体。

另外，由于凝血第八因子分子稳定性差，非常容易在强酸强碱等不适 宜的液体环境下降解而失活。这也是急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种筛选适用于检测凝血第八因子的单 克隆抗体的方法。本发明的另一目的在于提供一种筛选适用于分离纯化凝 血第八因子的单克隆抗体的方法。

本发明采用以下技术步骤组成的技术方案：一种筛选适用于检测凝血 第八因子的单克隆抗体的方法，包含以下步骤：

a.分别用全长凝血第八因子和B区缺失的凝血第八因子免疫动物， 用酶联免疫吸附法筛选抗凝血第八因子呈阳性的单克隆抗体；

b.用蛋白印记方法从以全长凝血第八因子免疫动物产生的阳性单克 隆抗体中筛选出抗B区的抗体，从以B区缺失的凝血第八因子免疫动物产 生的阳性单克隆抗体中筛选出抗A1+A2区的抗体；

c.分别选择抗A1+A2区的单克隆抗体，以及抗A1+A2区的单克隆 抗体和抗B区的单克隆抗体的混合抗体用于ELISA检测，对实验中所得 到的结果进行比较，筛选出适合作为ELISA检测的抗A1+A2区单克隆抗 体。

所述的全长凝血第八因子和B区缺失的凝血第八因子均为基因重组凝 血第八因子。