[发明专利]一种利用溴化己二甲胺提高基因转染猪皮转染效率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种提高携带外源基因的重组腺病毒载体转染猪皮效率的方法。 

背景技术

烧伤是一类发生率及致残率均较高的特殊类型创伤，其根本问题就是创面问题，如果烧伤创面得不到及时有效的覆盖、封闭，必将引起患者机体内环境的紊乱、感染及多脏器功能障碍的发生；此外，还可能出现创面的非生理性愈合，使疤痕形成增加，残疾程度加剧。因此，对烧伤创面进行皮肤移植的研究是现代烧伤治疗的迫切需要；也是烧伤研究的热点及难点。 

深度烧伤创面需经皮肤移植才能愈合，而大面积、特大面积烧伤患者自体皮源严重不足，需经非自体(同种异体或异种)皮覆盖创面方能取得较好的临床效果，同种异体皮(主要是尸体皮)是目前烧伤创面治疗中公认效果较好的生物敷料，但由于来源和伦理等多种条件限制，同种异体皮无法满足临床需求。猪皮由于与人皮在组织结构和生理功能上的高度相似性，是临床使用最为广泛的异种皮肤，但由于猪和人之间的种属差异，其排斥反应比较严重，无法起到长期覆盖作用。 

专利申请号为00103528.2，发明名称是“一种用重组基因转染的异体皮肤”的专利申请公开了利用传统的Ad5腺病毒载体携带免疫抑制基因CTLA4Ig对猪皮肤进行体外转染，可使CTLA4Ig蛋白在猪皮组织活细胞内表达，从而起到抑制免疫排斥的发生，在烧伤创面诱导移植皮肤局部特异性免疫耐受，达到延长移植异种皮肤成活的目的。 

但是，由于Ad5腺病毒载体和被转染细胞表面均带负电荷，相互之间存在静电排斥力，所以上述利用Ad5腺病毒载体携带免疫抑制基因CTLA4Ig对猪皮肤组织细胞的转染效率较低，需要较高滴度的病毒感染才能发挥效果，使得基因转染猪皮的生产成本较高。 

发明内容

本发明的目的是提供一种提高基因转染猪皮转染效率的方法，该方法可以提高Ad5重组腺病毒载体对猪皮肤细胞的转染效率。 

实现本发明目的的技术方案如下： 

一种利用溴化己二甲铵提高基因转染猪皮转染效率的方法，包括如下步骤： 

1)制备待转染的猪皮肤； 

2)使用浓度为5000-15000μg/ml溴化己二甲铵对10⁸PFU/ml Ad5重组腺病毒载体进行震荡混合，孵育后制备成转染液； 

3)将步骤2)制备的转染液对步骤1)制备的猪皮肤进行转染。 

其中，步骤1)所述猪皮肤是任何一种品系的猪皮肤，优选巴马香猪皮肤，进一步优选小于6个月猪龄的猪皮肤，最优选4-6月龄的巴马香猪皮肤。所述猪皮肤的厚度为0.1-1.0毫米，优选0.4-0.6毫米。 

其中，步骤2)中所述Ad5重组腺病毒载体含有CTLA4Ig重组基因，可按照专利申请号为00103528，发明名称是“一种用重组基因转染的异体皮肤”的专利申请公开的方法制备CTLA4Ig重组基因和含有CTLA4Ig重组基因的Ad5腺病毒载体。 

其中，步骤2)中所述孵育具体为：4℃孵育10-20分钟。 

其中，步骤3)中所述转染具体是在CO₂培养箱内37℃转染1-3小时。 

其中，步骤3)具体为：将步骤2)中处理后的转染液按0.8-2.2ml/cm² 的比例对步骤1)中处理后的猪皮肤在CO₂培养箱内37℃转染1-3小时。 

其中步骤3)优选将步骤2)制备的转染液按1ml/cm2的比例对步骤1)制备的猪皮肤在CO2培养箱内37℃转染2小时。 

本发明中使用的溴化己二甲铵(hexadimethrin bromide)具有中和肝素的作用，溶解后产生许多正电荷，凝聚胺(Polybrene)是溴化己二甲胺多聚物，带有多价阳离子。当溴化己二甲铵与Ad5重组腺病毒载体采用适合的比例混合后转染猪皮肤细胞时，可中和腺病毒载体和细胞表面的阴离子基团，降低了腺病毒载体和细胞表面之间的静电排斥力，从而增加腺病毒与细胞的相互接触，提高腺病毒载体对猪皮肤细胞的转染效率。 

本发明在体外利用溴化己二甲铵对Ad5重组腺病毒载体转染液进行处理，以此处理后的腺病毒转染液对猪皮组织进行转染，与未经处理的腺病毒转染相比，发现可以提高转染效率4-12倍，大大的提高了基因转染的效率，降低了生产成本。而且试验表明，溴化己二甲铵不会引起腺病毒载体和细胞的变性或失活，因此可以很好地发挥协助腺病毒载体对猪皮肤的转染作用。 

附图说明