[发明专利]狂犬病毒抗原的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备抗原的方法，尤其涉及一种利用重组杆状病毒在昆虫体内表达狂 犬病毒抗原基因或联合抗原基因的方法，用于制备注射和口服用狂犬病疫苗，属于基因工 程领域。

背景技术

狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies Virus，RV)侵犯中枢神经系统引起的人兽共患致死性 脑脊髓炎，一旦发病，死亡率几乎为100％。到目前为止无特效治疗药物，有效的办法只 有注射疫苗进行预防，因此对狗、猫和野生动物的大面积的预防免疫是控制和消灭狂犬病 的根本措施。目前我国兽用的狂犬病疫苗主要有灭活苗和弱毒苗。尽管传统疫苗在狂犬病 预防控制中仍占主导地位，但生产成本昂贵，免疫期短，疫苗制备过程中病毒逃逸等危险 因素很难避免。因此，传统疫苗亟需加以改进，研制安全、高效的狂犬病分子疫苗仍显得 非常必要。

随着生物技术、基因工程等高新技术的发展，人们意识到通过基因工程的手段，利用 生物反应器来高效表达狂犬病基因，可望达到大幅度提高狂犬病抗原产量、降低生产成本 的目的(ZHEN FANG Fu，Immunology，vol.88，pp.2001-2005，March 1991，)。

杆状病毒表达系统这一生物反应器是八十年代建立起来的。自从1983年首次利用杆 状病毒表达系统高效表达了人的α-干扰素以来(Smith，Mol.Cell Biol.，3：2156-2165，1983)， 已有数百个外源基因得到了高效表达，仅我国就有口蹄疫空衣壳粒子(李志勇等，Plos one， e2273，2008)，α-干扰素(杨冠珍等，生物化学与生物物理学报，22：355-361，1990)、 慈菇蛋白酶抑制剂(季平等，蚕业科学，21：223-227，1995)、马立克氏病毒糖蛋白B(肖 庆利等，蚕业科学，23：104-108，1997)等多种。利用此系统来生产狂犬病抗原的优点在 于：1.这一表达系统的表达效率极高，产量可达10毫克级/虫的水平。因而可大大降低狂 犬病抗原的生产成本并使通过基因工程方法大规模生产狂犬病抗原成为可能；2.这一表达 系统为真核表达系统，其表达的外源蛋白质可进行翻译后修饰，使其在生化性质和生物活 性等与天然产品相似，这为所表达的狂犬病抗原具有正常的蛋白结构和生物学免疫活性提 供了保证。目前，杆状病毒表达系统，尤其是其中的家蚕(Bm)-家蚕杆状病毒(BmNPV) 表达系统是世界上最具有商业开发价值的真核生物个体表达系统之一。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种利用杆状病毒表达系统 在昆虫体内安全、高效的同时表达多种狂犬病抗原的方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种制备狂犬病抗原的方法，包括：将狂犬病毒的抗原基因或抗原基因的联合表达组 合分别克隆到杆状病毒运载载体中，构建得到转移表达载体；将构建得到转移表达载体与 杆状病毒DNA进行共转染以发生同源重组或转座，将狂犬病病毒的抗原基因或抗原基因的 联合表达组合分别转移到杆状病毒的基因组上获得重组杆状病毒；用重组杆状病毒感染昆 虫宿主和细胞；培养被感染的昆虫宿主表达相应的狂犬病抗原；收获并纯化所表达的抗原， 即得。

其中，所述的狂犬病毒的抗原基因优选为狂犬病病毒抗原蛋白G基因(其核苷酸序列 为SEQ ID NO：1所示)或狂犬病病毒抗原蛋白N基因(其核苷酸序列为SEQ ID NO：3所 示)；所述狂犬病毒的抗原基因的联合表达组合为狂犬病病毒抗原蛋白G基因和狂犬病病 毒抗原蛋白抗原蛋白N基因的联合表达组合(即G-IRES-N组合基因)，其核苷酸序列为 SEQ IDNO：5所示；