[发明专利]从抗凝全血生产的自体或同种促凝剂

说明书

相关申请的交叉引用

本申请为要求2003年1月27日提交的美国临时申请60/442,974的优先权的非临时申请，该临时申请以其全部内容引入本申请作为参考。

技术领域

本发明涉及从抗凝全血生产速效的自体或同种促凝剂的方法。

背景技术

来源于人或动物血浆的凝血酶是一种有效的血液和血液衍生物(纯化血纤蛋白原、富血小板血浆(PRP)、血小板浓缩物(PC)、贫血小板血浆(PPP))的促凝剂。它作用于血纤蛋白原，将其转化为血纤蛋白，血纤蛋白导致血纤蛋白基质的形成。牛凝血酶(BT)作为止血剂的临床使用是常见的，不过人血浆源凝血酶只被许可与人血浆源血纤蛋白粘合剂，例如TISSEEL血纤蛋白粘合剂(Baxter公司)联合使用作为各种外科操作中的局部止血剂和伤口粘合剂。

牛源凝血酶已经被用作外科处置(surgical setting)中实现临床止血的标准(standard-of-care)数十年。它已经被用作制备溶剂洗涤剂处理的混合人血浆来源的血纤蛋白粘合剂的工具。牛凝血酶也被用于凝血实验室(clotlaboratory)(例如血库)制备的冷沉物和医疗点制备的(point-of-care-prepared)自体或同种富血小板血浆、血小板浓缩物或贫血小板血浆(分别为PRP、PC和PPP)。

与牛凝血酶使用相关的危险包括疾病传播(牛海绵样脑病，BSE)和抗人因子V抗体产生的可能性。尽管文献还没有报道临床应用牛凝血酶引起BSE传播，但已经报道了抗体的产生，其导致凝固时间异常(1-5)。已经报道局部接触经层析法纯化的牛凝血酶后出现人因子V的抑制物(6)。对局部牛凝血酶的接触导致抗多种蛋白和糖抗原的抗体产生。已经报道30％到50％的被接触患者有这些抗体，它们是心磷脂性质以及抗核抗体(7，8)。

由于牛凝血酶的使用所相关的这些问题，已经研究了从患者自身的血(自体)或供体血(同种)制备得到其它的促凝剂。

目前，本发明的发明人生产了一种具有1到5分钟凝固时间的前凝血剂，已证实当它与PRP或PPP合用施用于硬组织移植材料(例如，自体移植、同种异体移植、异种移植和人造的)时是有效的。施用于这些移植材料的组合物导致这些移植材料的固结，这提供了显著改善的操作性能以及简化的对手术缺损部位的转运。获得的这种形式的移植材料可与缺损部位适合并保持稳定。PRP和PC中的某些蛋白的存在也有助于缺损的更快速的愈合。

尽管具有1到5分钟凝固时间的前凝血剂在上述适应征中是有效的，但是它对某些软组织施用可能不是有效的，使得需要一种具有更快凝固时间的非牛促凝剂。实现止血通常需要大约10秒的凝固时间(一般用牛凝血酶)。更长的凝固时间是不太理想的，并且可能在控制毛细血管出血上是不太有效的。

迄今为止，对开发非牛、速效促凝剂的研究已经集中于分离血液的细胞成分，然后应用各种方法从血浆部分中分离蛋白。使用了例如冷沉淀法、物理化学沉淀法、微滤技术的使用、密度梯度技术等方法。已经分离和表征了血浆部分。

另外，也已研究了各种通常已知的沉淀剂，例如聚乙二醇(PEG)、硫酸铵和乙醇。这些试剂中的每一种在分离特定蛋白上都有某些优点，但也导致其它蛋白的部分沉淀。尽管如此，为实现分离方法的最大效率，这些沉淀剂已经被利用并施用于无细胞血浆。

直到最近，主要的焦点已集中在施用于无细胞血浆的各种强度例如10％到25％的乙醇的使用(例如参见美国专利6,274,090，其公开了一种从单个供体的血浆制备稳定的凝血酶成分的方法)。用这种方法制备凝血酶是费时的并需要多个步骤包括在将血浆与乙醇接触之前需要首先从全血制备血浆部分。

虽然某些强度的施用于血浆的乙醇已经提供了改进的凝固时间，例如5到10秒凝固PRP或PPP(美国专利6,274,090)，但是在制备组合物1小时后，凝固时间增加到大于25秒，并且在制备后2小时，凝固时间增加到大于40秒。

因此需要一种制备自体或同种促凝剂的方法，其中所述方法需要少量体积的全血，获得于少于20秒内导致凝块的促凝剂的产生；生产保持活性大于4小时的促凝剂；并且生产要求总制备时间少于60分钟的促凝剂。

发明内容

目前，本发明的发明人已经发现通过去除血浆分离步骤以及通过将沉淀剂直接加入抗凝全血中，得到了一种具有由组合物长时间保持的快速凝固时间的人促凝剂。因此，通过减少从全血中分离血浆部分所需的时间量减少了制备促凝剂所需的总时间。