[发明专利]一种鹿X/Y精子分离冷冻精液及其生产方法和应用

权利要求书

1.一种鹿X/Y精子分离冷冻精液的生产方法，由下述步骤组成：

1)采集公鹿新鲜精液2-5mL，其中的总精子数为25-50亿个，用TALP 液等倍稀释并添加抗生素，在18-20℃条件下保温；

2)检测新鲜精液的浓度和活力，只有活力在80％以上的样品可用于分离 处理，根据精液浓度折合体积取4亿精子离心去除精浆，添加10μg/mL Hochest 33342在24℃温水浴中染色30分钟；

3)鹿X/Y精子分离的DNA差异设定为2.8-3.0％，根据鹿X、Y精子DNA 含量差别设定流式细胞分离机参数，所述细胞分离机参数为第一相区初取精子 喷流总数的70％/第二相区原精液死精率15％＝X/Y单性精子分离取率40％， 通过流式细胞分离机分离X和Y精子，使X/Y精子分离速度控制在4000-5000 个/秒；

4)取分离的X或Y精子2亿，下机后以2000转/5分钟进行离心处理， 用冷冻平衡液A稀释到最终设计浓度的2倍，在4-5℃条件下放置60分钟， 所述冷冻平衡液A的PH为6.8，其由以下组分组成：291.7mM Tris三羟甲基 氨基甲烷、95.1mM柠檬酸、70.2mM果糖、20％卵黄和超纯水；

5)冷冻平衡液A平衡后，添加等量的含20％甘油冷冻保护剂的冷冻平衡 液B，在4℃冰箱平衡60分钟，所述冷冻平衡液B的pH值为6.8，由以下组 分组成：Tris三羟甲基氨基甲烷291.7mM、95.1mM柠檬酸、70.2mM果糖、 20％卵黄、20％甘油和超纯水；

6)把分离X或Y精液在4℃条件下装入冷冻管，制成浓度为200-400万 精子/0.25毫升的鹿X/Y精子分离冷冻精液。

2.根据权利要求1的所述的生产方法，其特征在于：所述抗生素为庆大 霉素0.8mg/mL，林可-奇霉素0.3mg/mL。

3.根据权利要求1的所述的生产方法，进一步包括如下步骤：将步骤6) 制得的鹿X/Y精子分离冷冻精液装入0.25mL冷冻管，置入-90℃的氮蒸汽中处 理60分钟，然后把精液管投入液化氮中保存。

4.将权利要求1所述的生产方法生产的鹿X/Y精子分离冷冻精液用于人 工授精或生产性控胚胎再进行胚胎移植。

5.根据权利要求4所述的鹿X/Y精子分离冷冻精液用于人工授精或生产 性控胚胎再进行胚胎移植，其特征在于：所述鹿X/Y分离冷冻精液人工授精剂 量为200-400万精子/只或次。