[发明专利]一种鹿X/Y精子分离冷冻精液及其生产方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种哺乳动物X/Y精子分离技术，特别涉及一种鹿X/Y精子 分离冷冻精液及其生产方法和应用。

背景技术

以家畜为主的冷冻精液、人工受精和体外受精技术广泛应用于生产繁育和 生殖生物学研究。在正常情况下，鹿的子代繁育公母各占50％，但是在生产实 际中，为了提高鹿的养殖效应，对于特定品系需要更多繁育母鹿(育种和扩群) 或公鹿(商品鹿茸生产)，于是就需要通过分离精子来控制鹿的子代性别。此 外，分离后的精子在授精前通常需要冷冻保存，而各个物种的不同，其对于pH 值、冷冻缓冲液及冷冻处理方法的要求也不同，这对冷冻条件及其缓冲液提出 了较高的要求。

CN1232231C公开了一种家畜X/Y精子分离的方法，该方法需要使用磷 酸缓冲溶液洗涤精液，通过流式细胞分离机分离，其速度为3000个/秒。然而， 使用该方法分离鹿的X/Y精子时，其分离速度、分离准确率、缓冲液使用、冷 冻保存后的精子活力等方面仍有较大提高空间。

CN101112392A公开了一种底剂量家畜精液及其生产方法，该方法通过使 用冷冻平衡液A(Tris-A)和添加了甘油的冷冻平衡液B(Tris-B)来处理多种家畜 精液，通过多种动物精液生理特性研究，发现特定异种动物精子间的受精促进 效果。该方法需要添加异种家畜的精液，使用该方法单独处理鹿的精子时，所 得到的鹿精子的数量和活力均不能达到理想产业化应用的水平。

发明内容

本发明的目的是提供鹿X/Y精子分离冷冻精液及其生产及方法和应用，可 以将鹿X/Y精子分离，并实现产业化生产和应用，从而控制鹿的子代性别。

本发明提供了一种鹿X/Y精子分离冷冻精液，包括冷冻平衡液A、冷冻平 衡液B和鹿X或Y精子分离冷冻精液，其含量如下：

冷冻平衡液A Tris-A 50％

冷冻平衡液B 含20％甘油冷冻保护剂的Tris-B 50％，其中：

鹿X或Y精子分离冷冻精液浓度为200-400万精子/0.25mL。

上述冷冻平衡液A，pH 6.8，由以下组分组成：

Tris三羟甲基氨基甲烷     291.7mM

柠檬酸                   95.1mM

果糖                     70.2mM

卵黄                     20％

超纯水；

并且，所述冷冻平衡液B，pH6.8，由以下组分组成：

Tris三羟甲基氨基甲烷     291.7mM

柠檬酸                   95.1mM

果糖                     70.2mM

卵黄                     20％

甘油                     20％

超纯水。

本发明还提供了上述的鹿X/Y精子分离冷冻精液的生产方法，包括下述 步骤：

1)从健康的公鹿采集新鲜精液2-5mL(总精子数25-50亿个)，由于鹿的 鲜精非常容易失去活力，因此需用TALP液保护。为抑制精液中细菌增殖用 TALP液等倍稀释并添加适量抗生素(庆大霉素Gentamicin：0.8mg/mL，林可- 奇霉素Linco-spectin：0.3mg/mL)，在18-20℃条件下保温，供X/Y精子分离使 用。每份新鲜精液在该条件下可使用6-8小时；

2)使用精子密度-活力仪检测新鲜精液的浓度和活力，只有活力在80％ 以上的样品可用于分离处理。根据精液浓度折合体积取4亿精子离心去除精浆， 添加10μg/mL Hochest 33342在24℃温水浴中染色30分钟；

3)鹿X/Y精子分离的DNA差异设定为2.8-3.0％，根据鹿XY精子DNA 含量差别设定流式细胞分离机参数(第一相区初取精子喷流总数的70％/第二 相区原精液死精率15％＝X/Y单性精子分离取率40％)，通过流式细胞分离机 分离X和Y精子，使X/Y精子分离速度控制在4000-5000个/秒，X或Y精子 分离纯度达到85-95％；