[发明专利]一种转录调控蛋白及其制备和应用

权利要求书

1.一种转录调控蛋白，其特征在于：为序列表SEQ ID No.1中的碱基 序列所编码的蛋白。

2.一种按权利要求1所述的转录调控蛋白的制备方法方法，其特征在 于：1)质粒pBTWF1的构建：以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，用引物ERFA和 ERRA进行PCR扩增，扩增产物与载体pBS-T于室温连接2-4小时，连接 混合液转化大肠杆菌DH5α后在含有安卡青霉素、Xga1和异丙基-β-D-硫 代半乳糖苷的LB固体培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即 为质粒pBTWF1；所述引物为ERFA5’-GGATCCGATTAGGATCGACTAGCCA-3’， 和ERRA5’-GATATCCGTCGAGTGTTAGGCTC-3’：

2)质粒pBTWF2的构建：将上述步骤1)质粒pBTWF1用BamHI／EcoRV 酶切，回收0.7kb片段；将质粒pBR322用BamHI／NruI酶切，回收3.7kb片 段，将两段回收的酶切片段用T4DNA连接酶于16℃连接8—16小时，连接 液转化入大肠杆菌DH5后在含有安卡青霉素的LB固体培养基上培养 18-24小时，筛选转化子，提取质粒，即为质粒pBTWF2，其为具有序列表 SEQ ID No.1中的碱基序列所编码蛋白；

所述迟缓爱德华氏菌TX1保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，保藏日期2008年1月9日，保藏编号为CGMCC No.2330。

3.按权利要求2所述的转录调控蛋白的制备方法，其特征在于：所述 PCR条件为：94℃60s预变性模板DNA，然后94℃40s，58℃60s，72℃60s， 5个循环后改为94℃40s，61℃60s，72℃60s，25个循环后再在72℃延伸 反应10min。

4.一种按权利要求1所述的转录调控蛋白的应用，其特征在于：通过反 义RNA干扰所述序列表SEQ ID No.1中碱基序列所编码的蛋白使其具有降 低细菌毒力的作用。

5.按权利要求4所述的转录调控蛋白的应用，其特征在于：所述通过反 义RNA干扰具有所述序列表SEQ ID No.1中碱基序列所编码的蛋白的方法 为：1)质粒pBTR1构建：以质粒pTrcHi s为模板，采用引物TRF1和TRR1 进行PCR扩增，扩增产物与质粒pBS—T连接，连接混合液转化大肠杆菌后 在含有安卡青霉素、Xga1和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB固体培养基上 培养18-24小时，筛选出转化子提取质粒，即为pBSER1；将质粒pBSER1与 质粒pBR322用EcoRI／BamHI双酶切，分别回收130bp和4kb片段；将上述 回收片段用T4DNA连接酶连接2-4小时，连接混合液转化大肠杆菌后在含 安卡青霉素的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为 pBTR1；所述引物TRF1为5’-GAATTCATTAATCACTGCATAATTCGTG-3’；TRR1 为5’-GGATCCATGATATCATTATACGAGCCGGATG-3’；

2)质粒pBTR2构建：以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，采用引物ERR3和 ERF1进行PCR扩增，扩增产物与质粒pBS—T连接，连接混合液转化大肠杆 菌后在含有安卡青霉素、Xga1和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB固体培养 基上培养18-24小时，筛选出转化子提取质粒，即为质粒pBSER2；将质粒 pBSER2与步骤1)所的质粒pBTR1用EcoRV／BamHI酶切，分别回收0.7kb和 3.9kb片段；将上述回收片段用T4DNA连接酶连接2-4小时，连接混合液转 化大肠杆菌后在含安卡青霉素、Xga1、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB培 养基中培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为pBTR2；其中引物ERR3 为5’-GCAGATATCCGTCGAGTGTTAGGCTC-3’；ERF1为5’- GGATCCAGTACTGATTAGGATCGACTAGCC-3’：

3)质粒pJA1的构建：以质粒pBR322为模板，采用引物APF1和APR4 进行PCR，扩增产物用EcoRI酶切，回收1kb片段，将其与质粒pDN18的7.8kb EcoRI酶切片段用T4DNA连接酶于室温连接2—4小时，连接液转化入大肠 杆菌DH5α后在含有Ap的LB固体培养基上培养18-24小时，挑取转化子提 取质粒，即为pJA1；其中引物APF1为5’-TATGAATTCTTGAAGACGAAAGGG-3’ 和APR4为5’-TAAGAATTCAAATGAGTAAACTTGGTCTG-3’；

4)质粒pERI26的构建：将步骤3)质粒pJA1用EcoRV酶切，回收8.8kb 片段；同时将步骤2)质粒pBTR2用ScaI酶切，回收1.3kb片段，将两段 回收片段用T4DNA连接酶于室温连接2—4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5 α后在含有Ap的LB固体培养基上培养18-24小时，挑取转化子提取质粒， 即为具有序列表SEQ ID No.1中相反碱基序列的质粒pERI26；

所述迟缓爱德华氏菌TX1保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，保藏日期2008年1月9日，保藏编号为CGMCC No.2330。