[发明专利]一种转录调控蛋白及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学以及基因工程领域，具体的说是一种迟缓爱德 华氏菌溶血素基因调控蛋白及其制备和应用。

背景技术

迟缓爱德华氏菌为一种重要的水产养殖动物病原菌，能够感染多种养 殖淡、海水鱼类，如鲤鱼、罗非鱼、牙鲆、鳗鲡、鳍鱼、真鲷等。目前已 发现的迟缓爱德华氏菌致病因子主要有三类和六类分泌系统、溶血素以及 粘附素等。其中Eth溶血素系统由EthA和EthB组成；EthA为溶血素因子， 能直接与宿主细胞作用而造成溶血现象；EthB为EthA的运输及激活因子， 因而EthA的分泌及功能活性依赖于EthB。由于Eth溶血素为一重要毒力 因子，与细菌致病力密切相关，因而其表达受到严格调控，破坏这种调控 可导致细菌致病力的降低。

发明内容

本发明目的在于提供一种转录调控蛋白及其制备和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

转录调控蛋白：具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列。

转录调控蛋白的制备方法方法：1)质粒pBTWF1的构建：以迟缓爱德 华氏菌TX1为模板，用引物ERFA和ERRA进行PCR扩增，扩增产物与载 体pBS-T于室温连接2-4小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5α后在含有安 卡青霉素、Xgal和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB固体培养基上培养 18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pBTWF1；所述引物为ERFA5’ -GGATCCGATTAGGATCGACTAGCCA-3’，和ERRA 5’-GATATCCGTCGAGTGTTAGGCTC -3’；

2)质粒pBTWF2的构建：将上述步骤1)质粒pBTWF1用BamHI/EcoRV 酶切，回收0.7kb片段；将质粒pBR322用BamHI/NruI酶切，回收3.7kb片 段，将两段回收的酶切片段用T4DNA连接酶于16-？℃连接8-16小时， 连接液转化入大肠杆菌DH5α后在含有安卡青霉素的LB固体培养基上培养 18-24小时，筛选转化子，提取质粒，即为质粒pBTWF2，其为具有序列表 SEQ ID No.1中的碱基序列的转录调控蛋白。所述PCR条件为：94℃60s预 变性模板DNA，然后94℃40s，58℃60s，72℃60s，5个循环后改为94℃40s， 61℃60s，72℃60s，25个循环后再在72℃延伸反应10min。

转录调控蛋白的应用：通过反义RNA干扰具有所述序列表SEQ ID No.1 中碱基序列的转录调控蛋白使其具有降低细菌毒力的作用。

所述通过反义RNA干扰具有所述序列表SEQ ID No.1中碱基序列的转录 调控蛋白的方法为：1)质粒pBTR1构建：以质粒pTrcHis为模板，采用 引物TRF和TRR1进行PCR扩增，扩增产物与质粒pBS-T连接，连接混合 液转化大肠杆菌后在含有安卡青霉素、Xgal和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 的LB固体培养基上培养18-24小时，筛选出转化子提取质粒，即为pBSER1； 将质粒pBSER1与质粒pBR322用EcoRI/BamHI双酶切，分别回收130bp和 4kb片段；将上述回收片段用T4DNA连接酶连接2-4小时，连接混合液转化 大肠杆菌后在含安卡青霉素的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提 取质粒，即为pBTR1；所述引物TRF1为5’-GAATTCATTAATCACTGCATAATTCGTG -3’；TRR1为5’-GGATCCATGATATCATTATACGAGCCGGATG-3’；