[发明专利]一种利用真菌诱导子提高灵芝酸含量的灵芝菌丝体液体发酵方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用真菌诱导子生产高产量灵芝酸的液体发酵方法。

背景技术：

灵芝(Ganoderma lucidum)为担子菌纲、多孔菌科、灵芝菌属真菌。现代药理学研究表明灵芝具有抗肿瘤、抗衰老、防止动脉硬化等作用，而且对心脑血管疾病具有较高的药理活性。灵芝中的多糖、三萜类物质(主要为灵芝酸)、生物碱、氨基酸多肽、微量元素等成分是灵芝的药效物质基础。其中灵芝酸是灵芝治疗高血压、高血脂、失眠和多种呼吸系统疾病(如去痰、止咳、平喘)以及抗肿瘤等的物质基础。在灵芝药用价值被广泛揭示的同时，灵芝的产量成为抑制灵芝应用的限制因素，因为在自然界中野生灵芝十分稀少，且其中灵芝酸含量仅为1毫克/100毫克干重，远不能满足人们的需要。同灵芝人工栽培相比，发酵法生产灵芝有效成分由于生产周期短、劳动力省以及受外部环境影响小等优点被认为是一种有效的方法。

近年来，利用特定的真菌菌株的提取物作为诱导子来提高植物细胞中某些次生代谢产物的积累量，在植物细胞悬浮培养中已获得了巨大成功。但是，将真菌诱导子用于食药用真菌细胞培养的报道很少，目前仅见关于用真菌诱导子提高虫草菌素液体发酵生产的报道，而用于灵芝发酵培养以提高灵芝酸产量等次生代谢产物的研究尚未见报道。

发明内容：

本发明的目的在于克服上述已有技术的不足而提供一种工艺简单、成本低、效果显著，灵芝酸含量高的利用真菌诱导子生产高产量灵芝酸的液体发酵方法，本方法可用于灵芝酸的工业化生产。

本发明的目的可以通过如下措施来达到：一种利用真菌诱导子提高灵芝酸含量的灵芝菌丝体液体发酵方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)真菌诱导子的制备：

①真菌诱导子菌株的培养：将真菌诱导子菌种接种于PDA斜面培养基上活化后，转接到PDA平板培养基上，25～30℃培养3～5天，取菌块接种于装有PDA液体培养基的三角瓶中，于25～30℃、100～180r/min摇床中培养5～7天后，过滤得到菌丝体备用；

②真菌诱导子制备：将真菌诱导子菌丝体于60～70℃下烘干，研磨破碎，按重量体积比1∶2～1∶5的比例加入浓度为65～85％乙醇，在室温下浸泡10～15小时，减压抽滤，收集滤渣，滤渣按重量体积比1∶2～1∶5的比例加入氯仿和正丁醇的混合液，氯仿与正丁醇的体积比为3∶1～5∶1，洗滤渣3～5次，然后滤渣按重量体积比1∶3～1∶5的比例用丙酮冲洗后，滤渣按重量体积比1∶3～1∶5的比例再用水冲洗，自然风干，干物质按重量体积比1∶5～1∶7的比例加入浓度为5～15％三氟乙酸，沸水浴酸解0.5～2小时，水解物过滤，取滤液，用NaOH中和至pH为4～7，在3℃～8℃下静置10～15小时，过滤除菌，制成真菌诱导子，冷冻保存；

(2)灵芝的液体发酵培养：

将斜面保藏的灵芝菌种接种到PDA平板培养基上，进行活化培养，培养温度25～30℃，培养时间5～10天，然后取菌块接种于装有液体发酵培养基的中三角瓶进行发酵培养，摇床转速100～180r/min，温度25～30℃，时间5～8天；

液体发酵培养基组成：葡萄糖20～50g/L、酵母膏2～8g/L、蛋白胨2～8g/L、磷酸二氢钾0.5～2.0g/L、硫酸镁0.1～1.0g/L、维生素B₁0.01～0.10g/L，余量为蒸馏水；

(3)灵芝与真菌诱导子共培养：

在灵芝液体发酵培养第1～5天，加入真菌诱导子，使真菌诱导子浓度达到40～120μg/mL，然后继续培养2～7天，得到灵芝菌丝体。

为了进一步实现本发明的目的，所述的真菌诱导子菌种为枝顶孢属真菌顶头孢(Acremonium strictum)，菌种编号CGMCC No.3.2058；或木霉属真菌木素木霉(Trichoderma viride)，菌种编号为CGMCC No.3.2196；或轮枝菌属真菌蘑菇轮枝孢(Verticillium psalliotae)，菌种编号为CGMCC No.3.4423。

为了进一步实现本发明的目的，所述的发酵用灵芝菌种为普通栽培品种(Ganoderma lucidum)，购自中国普通微生物菌种保藏中心，编号为CGMCC No.5.644。

为了进一步实现本发明的目的，所述的真菌诱导子菌株的培养步骤中取直径0.3～0.6cm的菌块3～5块，接种于PDA液体培养基中，每500mL三角瓶装PDA液体培养基100～200mL。