[发明专利]一种牙鲆弹状病毒的检测方法

权利要求书

1、一种牙鲆弹状病毒的检测方法，其特征在于先设计特异性引物序列和荧光探针序列，然后提取待测样品的核酸；再进行实时定量逆转录一聚合酶链式反应，同时利用体外转录含有目的扩增片段的核糖核酸作为标准品绘制标准曲线；最后根据计算得到的待测样品的循环阀值判定待测样品中是否含有牙鲆弹状病毒并进行定量。

2、根据权利要求1所述的牙鲆弹状病毒的检测方法，其特征在于所述的设计特异性引物序列和荧光探针序列是：选取牙鲆弹状病毒的糖蛋白基因保守序列，利用已有的软件设计特异性引物和荧光探针序列为：

正向引物：5′-ACCGCCAAGAGTGTCCTTAGAG-3′

反向引物：5′-TGGAGCACTTCCCTTCAATAAAA-3′

荧光探针：5′-FAM-TCCTTACACCCTGGGATTCCTTGATTCTG-TAMRA-3′。

荧光探针的5′端标记荧光报告基团6-羧基荧光素，3′端标记荧光淬灭基团6-羧基四甲基罗丹明，扩增片断长度为76bp。

3、根据权利要求1所述的牙鲆弹状病毒的检测方法，其特征在于所述的提取待测样品的核酸是：采用传统的TRIZOL法或者商业化的RNA提取试剂盒提取待测样品的RNA之后用核酸分析仪进行OD₂₆₀/OD₂₈₀检测。

4、根据权利要求1所述的牙鲆弹状病毒的检测方法，其特征在于所述的进行实时定量RT-PCR反应是：在PCR反应管中加入待测样品的核酸、实时定量RT-PCR反应液，正向引物、反向引物、荧光探针，补充水至25μL；反应程序为：48℃-52℃反应30-60min；95℃反应10min；之后95℃反应15sec-30sec，57℃-63℃再反应30sec-1min；进行40个循环；其中，实时定量RT-PCR反应体系中各组分构成比例为：12.5μL2×实时定量RT-PCR反应液，10μmol/L正向引物1-2μL、10μmol/L反向引物1-2μL，10μmol/L的荧光探针0.5-1μL，100ng/μL-200ng/μL待测样品的RNA 1-5μL，补充双蒸水至25μL。

5、根据权利要求1所述的牙鲆弹状病毒的检测方法，其特征在于所述的利用体外转录含有目的扩增片段的RNA作为标准品绘制标准曲线是：先将PCR产物电泳后切下含有目的片段的凝胶，用凝胶纯化试剂盒纯化，与pGEM-T载体4℃过夜连接，转化感受态细胞，转化产物涂平板培养，挑取白斑PCR产物鉴定阳性后测序，根据测序结果将筛选的阳性克隆接种到含氨苄青霉素的溶菌肉汤培养基，过夜培养，制备质粒脱氧核糖核酸纯化后，经过Nco I酶切后，利用T7启动子体外转录制备RNA模板，乙醇沉淀后于紫外分光光度计测定OD₂₆₀定量，并梯度稀释，为1×10⁷-1×10¹拷贝/μL；将梯度稀释的标准品进行实时定量RT-PCR反应；定量PCR仪器计算Ct值，根据标准品的浓度和Ct值，由仪器软件自动绘制出标准曲线。

6、根据权利要求1所述的牙鲆弹状病毒的检测方法，其特征在于所述的根据仪器软件得到的待测样品的Ct值判定待测样品中是否含有牙鲆弹状病毒并进行定量是：利用实时定量PCR仪器收集荧光信号，再利用仪器软件处理数据，得到待测样品的循环阈值；当待测样品的Ct值≤35.0时，判定待测样品中含有牙鲆弹状病毒，其病毒含量通过Ct值和标准曲线由定量PCR仪器软件自动计算；当Ct值＞35.0时，判定待测样品中不含有牙鲆弹状病毒。