[发明专利]一种牙鲆弹状病毒的检测方法

说明书

技术领域：

本发明属于水产动物病原的检测与诊断技术领域，涉及一种牙鲆弹状病毒的检测方法，特别是一种采用实时定量逆转录-聚合酶链式反应(简称RT-PCR)技术检测鱼类牙鲆弹状病毒的方法。

背景技术：

牙鲆弹状病毒(Hirame rhabdovirus，简称HRV)病毒粒子呈枪弹形，大小为80nm×160-180nm，1986年日本首次报道。我国黄海、渤海近岸等地养殖的牙鲆已被发现有此病症。发病季节为冬季和早春，鱼体发病时，水温一般都在15℃以下。本病主要危害牙鲆，人工感染对真鲷、黑鲷有强烈的致病性，从香鱼和无备平鮋中也分离到此病毒，对虹鳟也有致病作用。幼苗期和仔鱼期的鱼体易患此病。感染牙鲆弹状病毒的病鱼体表和鳍充血或出血，腹部膨胀，内有腹水。解剖鱼体，肌肉、肠黏膜的固有层出血，生殖腺的结缔组织充血或出血。

中国国家质量监督检验检疫总局与韩国海洋水产部于2005年发布的《中韩进出口活水生动物检验检疫协议》中规定，我国出口到韩国的鲈鱼、真鲷、大菱鲆、牙鲆等鱼类必须进行牙鲆弹状病毒的检验检疫。因此，迫切需要建立快速、灵敏、准确的牙鲆弹状病毒的检测方法，打破国外技术壁垒，为国家贸易服务。目前鱼类病毒的检测方法主要包括细胞学诊断技术、免疫学诊断技术、分子生物学诊断技术三大类：细胞学诊断技术主要包括采用细胞培养分离病毒、组织病理切片及电镜观察，其操作繁琐，检测周期长，且灵敏度低；免疫学诊断技术主要包括免疫荧光检测、免疫点杂交，其方法具有特异性强、敏感性高的优点，但方法相当繁琐，不适宜对大量样品进行检测；分子生物学诊断技术主要包括聚合酶链式反应(PCR)，比较快速、灵敏，但是需要琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色观察结果，溴化乙锭是致癌物，对人体和环境有危害，并且交叉污染问题比较严重；另外PCR只能进行定性检测，不能对病毒进行定量检测。

现有的牙鲆弹状病毒检测方法一般采用细胞学诊断方法，而实时定量PCR技术目前已被广泛应用于检测水产动物病原，如细菌(对虾弧菌、贝副溶血弧菌)、对虾病毒(对虾白斑综合症病毒、涛拉综合征病毒、黄头病毒)、鱼类病毒(传染性造血器官坏死病毒、锦鲤疱疹病毒、传染性胰脏坏死病毒、真鲷虹彩病毒)等，据检索，目前尚未见采用实时定量RT-PCR技术检测牙鲆弹状病毒的报道。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术中的缺点，寻求提供一种利用荧光探针定量检测牙鲆弹状病毒的灵敏度高，特异性好，定量快速准确的方法，为国内水产养殖业和国际鱼类贸易的可持续健康发展提供技术支撑。

为了实现上述目的，本发明的主要原理是采用荧光探针法实时定量PCR技术，在反应体系中包括一对PCR引物和一条荧光探针；荧光探针可以与模板特异性地结合，结合位点在两条引物之间，荧光探针的5′端标记有荧光报告基团(R)，3′端标记有荧光淬灭基团(Q)。当探针完整的时候，报告基团所发射的能量由于荧光共振能量转移(FRET)而被淬灭基团吸收，因此反应体系中检测不到荧光信号；在PCR反应过程中，引物和探针都与模板结合，Taq酶发挥5’-3’外切核酸酶活性，将荧光探针切断从而使荧光报告基团远离淬灭基团，因此产生仪器可以检测到的荧光信号；随着PCR循环次数的增加，释放出来的荧光信号不断增加，荧光信号强度与扩增产物的数量呈正比关系，仪器记录荧光信号强度，最终计算出循环阈值(简称Ct值)；Ct值是指荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数，Ct值与模板的初始拷贝数成反比，初始拷贝数越多，Ct值越小；利用已知拷贝数的标准品制备出标准曲线，再根据样品的Ct值对样品中的牙鲆弹状病毒进行定量检测。

本发明的技术方案是先设计特异性引物序列和荧光探针序列，然后提取待测样品的核酸；再进行实时定量逆转录-聚合酶链式反应，同时利用体外转录含有目的扩增片段的核糖核酸(简称RNA)作为标准品绘制标准曲线；最后根据仪器软件计算得到的待测样品的循环阀值判定待测样品中是否含有牙鲆弹状病毒并进行定量。

本发明所述的设计特异性引物序列和荧光探针序列是：选取牙鲆弹状病毒的糖蛋白(Glyprotein)基因保守序列，利用已有的Primer Express 2.0软件设计特异性引物和荧光探针序列为：

正向引物：5′-ACCGCCAAGAGTGTCCTTAGAG-3′

反向引物：5′-TGGAGCACTTCCCTTCAATAAAA-3′

荧光探针：5′-FAM-TCCTTACACCCTGGGATTCCTTGATTCTG-TAMRA-3′。