[发明专利]一种用于海水双壳类减数分裂器的免疫荧光显微观察方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞化学及细胞免疫学，具体是一种用于海水双壳类减数分裂器的免疫荧光显微观察方法。

背景技术

海洋贝类是我国海水养殖的主导种类，在我国的海水养殖业中占有举足轻重的地位。利用生物技术培育优良的养殖品种，是当前乃至未来发展海水贝类养殖亟待解决的关键问题之一。受精是个体发育的前提和基础，是苗种培育的第一步。在水产养殖生产中，受精的质量关系苗种培育的成败。

20世纪80年代以来，海水经济贝类的染色体操作和细胞工程育种技术得到广泛研究，多倍体和非整倍体形成的受精生物学机制研究取得了许多进展。此外在广泛开展的贝类杂交育种研究中，其受精过程的观察和受精机制的研究是必要的组成部份。

国内外学者已经对牡蛎、珠母贝、贻贝、扇贝等主要经济双壳类的受精过程进行了深入细致的观察与研究，研究手段从普通光学显微镜发展到荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜，研究内容涉及海水双壳类受精相关事件。近年来，利用免疫细胞化学技术结合荧光显微观察，对海水双壳类受精过程中相关细胞成分(如微管)的定位和动态变化的研究取得了一定进展。

在海水双壳类中开展的大量受精生物学研究表明绝大部分的海水双壳类为卵生型，雌雄配子被排放到海水中完成受精过程。排放的卵子处于第一次减数分裂前期(生发泡期)或中期。精子入卵后，受精卵恢复减数分裂，形成减数分裂器(包括减数分裂纺锤体和染色体)，伴随减数分裂过程，纺锤体和染色体发生一系列动态变化，形成雌雄原核并最终启动卵裂。

目前，对受精过程的染色体动态研究采用了各种染色方法，包括采用常规碱性染料(地衣红、苏木精等)在普通光学显微镜下观察了长牡蛎、栉孔扇贝的染色体行为，采用荧光染料DAPI在荧光显微镜下观察栉孔扇贝和泥蚶受精过程的染色体行为，但限于荧光强度有限，对比度较低，无法定量研究染色体。前者虽然清晰度高，但其样品处理决定了只能适用于可见光显微观察，无法开展荧光显微观察。上述技术方法均无法揭示纺锤体的动态。

迄今国内外仅有一个关于利用荧光染色的方法观察长牡蛎Crassostreagigas减数分裂纺锤体形态的报道。该研究采用免疫荧光间接法，第一步用鼠抗β微管蛋白抗体标记样品的微管，第二步用荧光素(FITC)标记的羊抗鼠抗体与第一抗体结合反应。免疫荧光间接法步骤较多，容易引起非特异性染色。由于其局限性，该方法未能得到推广应用。

综上所述，已报道的海水双壳类受精生物学研究所应用的荧光染色方法多是对减数分裂器的一部分(纺锤体或染色体)进行观察，割裂了减数分裂的生物学过程，无法揭示纺锤体和染色体的相互作用，妨碍了对受精机理研究的进一步深入。在广泛借鉴动物细胞骨架免疫荧光显微研究技术的基础上，本发明提供了一种用于海水双壳类减数分裂器的免疫荧光显微观察方法，实现了同步观察减数分裂过程中的纺锤体和染色体动态，特异性强，清晰度高，突破了海水双壳类受精生物学研究的技术瓶颈，显著提高了研究效率。

发明内容

本发明的目的是提供了一种用于海水双壳类减数分裂器的免疫荧光显微观察方法。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

用于海水双壳类减数分裂器的免疫荧光显微观察方法，将样品经固定等预处理、染色、制片后即可观察，将样品采用质量百分比浓度2-6％多聚甲醛的磷酸缓冲液(PBS)固定，再依次进行透化和封闭处理，而后对样品纺锤体进行免疫荧光染色而后用含5-20mg/L碘化丙锭的磷酸缓冲液对染色体进行荧光染色；染色后将样品制片即可在荧光显微下观察。