[发明专利]一种用有核红细胞进行唐氏综合症产前基因筛查的方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种用有核红细胞(Nucleated red blood cell，NRBC)进行唐氏综合症产前基因筛查的方法和试剂盒，属于分子细胞生物学检测领域。具体是涉及一种用孕妇外周血中的胎儿NRBC经分离纯化来检测21号染色体倍性的荧光定量PCR的试剂盒，可以应用于像唐氏综合症等遗传物质异常的产前筛查。

技术背景

唐氏综合症(Down Syndrome，DS)，又称为先天愚型，是活产胎儿中最常见的染色体异常综合征之一，其发病率约为1/600-1/800。DS的体征非常多样，通常涉及多种组织器官的异常，但其最突出、最严重的临床表现为精神发育迟滞。该病的主要临床特征为：严重智力低下，且智力低下的表型随年龄增长逐渐明显，动作发育和性发育迟缓，基本无生活自理能力。DS绝大多数都是偶发的，每个孕妇都有生患儿的可能，发病无明显的种族差异和家族聚积现象，各种族之间发病率也几乎相同。

DS的发病机制是染色体减数不分离。正常情况下减数分裂时DNA复制一次，细胞连续分裂两次，而DS的发病原因大部分是由于第一次减数分裂时同源染色体不分离，造成子代细胞较正常细胞多一条染色体，第二次减数分裂时姐妹染色体既使分裂正常，受精后也会成为21三体，导致DS。还有少数情况是第二次减数分裂时姐妹染色体不分离所至，迄今为止，医学上对此类疾病尚无有效的预防和治疗措施，唯一可以采取的手段就是通过产前筛查、产前诊断尽可能早期发现，终止妊娠来防止患儿出生，国外许多国家在八十年代已将其列为必检项目。因此，开展唐氏综合征产前筛查、产前诊断对于提高我国人口素质具有重大意义，是优生的重要内容之一。

目前的临床上应用的检测方法是先进行血清标记物含量筛查，通过专业软件运用统计学方法测算出该孕妇生唐氏综合症患儿的风险率，高于设定值的孕妇建议作羊水穿刺，作染色体分析，以最终确诊。然而，上述筛查方法的假阳性率高达99％以上，而漏检率仍超过20％，因此远远不能满足实际需要。另外，目前确诊唐氏儿方法是传统的羊膜腔穿刺取羊水或绒毛膜细胞培养，进行染色体分析，这种技术诊断时间长，约3周左右，且具有一定的危险性。因此，该方法虽被认是一种较安全可靠的诊断方法，诊断精确度较高，但诊断率低，即使是高龄孕妇也不愿采用此法，病人依从性太差，不能作为筛查技术应用。

因此建立无创性产前诊断取材方法，降低产前诊断的风险是产前诊断工作的一项重大课题。利用孕妇外周血胎儿细胞进行产前诊断即是最具前途的无创性产前诊断方法之一，因对于胎儿没有任何风险，对孕妇无痛苦，易被接受推广，近年来研究十分活跃，是遗传病产前诊断的发展方向。

孕妇外周血存在胎儿细胞已被国内外许多研究所证实。孕妇外周血中胎儿细胞包括胎儿有核红细胞、胎儿淋巴细胞、胎儿滋养细胞及粒细胞，可见通过胎盘屏障进入母体循环的胎儿细胞是一个混合群体。将适宜于进行产前诊断的靶细胞从母体外周血中分离出来是实施无创伤性产前诊断的前提。目前国内外学者的研究集中在胎儿有核红细胞上，并一致认为胎儿有核红细胞是最佳的靶细胞。理由是：NRBC具有如下特征：(1)可在妊娠早期(早至妊娠第四周)出现，寿命短(不超过90天)，便于早期诊断；(2)可表达出特殊的抗原成分，便于富集；(3)可发生特殊的血红蛋白反应，便于鉴定；(4)携带胎儿全部遗传信息(基因组)，便于遗传学和分子生物学分析。如何对上述细胞尤其是母体外周血中胎儿有核红细胞加以富集、分离并进行胎儿基因诊断，是目前产前诊断研究的一个热点。国内外学者大多利用各种胎儿细胞表面特异抗原的单克隆抗体，经流式细胞计数仪分离纯化胎儿细胞，但这些NRBC绝大多数为母源性，胎源性NRBC比例很低，Reading等报道在每毫升母用1.083和1.090g/ml两种不同密度梯度的Percoll分离液对母体外周血单个核细胞进行分离，经FISH和γ珠蛋白单抗标记后进行FACS证实，高密度梯度的分离液可显著提高胎儿细胞的产量。

综上所述，目前国内外关于这方面的研究都存在胎儿细胞富集、分离的数量少，纯度不高，操作过程复杂，并且应用于产前诊断的疾病范围非常有限，使得该项工作没有根本的突破。因此建立一套稳定可靠、操作简便、富集力强、分离纯度高的富集和分离胎儿有核红细胞的新方法，才能更好地应用于产前多种遗传性疾病的诊断。

采用不同密度梯度的Percoll分离液对母体外周血单个核细胞进行分离，再联合应用抗CD71抗体磁珠正筛选，可以从母血中有效分离有核红细胞，解决胎儿有核红细胞难以分离纯化的问题，为无创取材铺平道路。