[发明专利]一种结核分枝杆菌快速药敏检测试剂盒及其检测方法

说明书

(一)技术领域

本发明属于分枝杆菌药敏检测领域，具体涉及一种结核分枝杆菌快速药敏检测试剂盒及其检测方法。

(二)背景技术

作为一种古老的传染病，结核病的疫情在全球呈上升趋势。据WTO估计，目前全世界约有20亿人感染结核杆菌，每年有800万新发病例和300万人的死亡。在我国，根据2000年第四次全国结核病调查估算，全国约有5.5亿结核病例，将近全国人口的一半。我国目前结核病的形式严峻。尽快建立先进的诊断技术和治疗措施，是一个紧迫的任务。不仅关系到千万人身心健康，也是关系到国民生计和国家经济发展的重要问题。

当前各医院及医疗机构在治疗结核病的过程中仍然沿用传统的方法即:从病灶部位或痰中分离活的菌体，分离培养进行纯化，挑取纯化的细菌进行药敏实验。由于结核分枝杆菌生长缓慢一般需20-30天左右，而药敏实验同样需要20-30天，整个药敏试验需要2-3个月才能得到结果，这样就严重影响病人的及时正确用药。临床医生往往为了减轻病人的痛苦，在没有药敏结果的情况下凭经验先给病人用药，这就带有很大的盲目性，这也是当前结核杆菌耐药率非常高而且结核病的死亡率高的主要原因，严重影响人们的健康。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种结核分枝杆菌快速药敏检测试剂盒及其检测方法，能够实现结核分枝杆菌药敏性的快速检测。

本发明采用的技术方案如下:

一种结核分枝杆菌快速药敏检测试剂盒，包含有标本处理试剂、分离纯化试剂、药敏培养试剂、细胞活性检测试剂，其中所述的细胞活性检测试剂为alamar blue指示剂。

所述的分离纯化试剂包括纳米免疫磁性微珠，免疫磁性微珠上包被有结核分枝杆菌特异性的膜抗体。

所述的标本处理试剂是氢氧化钠和半胱氨酸，一般氢氧化钠的质量浓度为4％。

所述的药敏培养试剂包括培养基、选择剂、结核分支杆菌生长因子、抗结核分支杆菌用一线及二线抗生素，抗生素分为低浓度和高浓度两种，同时设有空白对照。

以上所述的标本处理试剂、分离纯化试剂、药敏培养试剂、alamar blue指示剂都可以直接购买市售产品得到。

本发明还提供了一种所述结核分枝杆菌快速药敏检测试剂盒的检测方法，具体如下:先用标本处理试剂处理标本使之液化，然后利用纳米免疫磁性微珠富集纯化标本，之后将免疫磁性微珠加入药敏培养试剂中进行培养，培养试剂中加入浓度为8-12％的细胞活性指示剂alamar blue，培养温度为35-37℃的条件下培养48-72h；然后利用分光光度计、荧光检测仪或目测方法进行检测。

本发明旨在通过alamar blue细胞活性指示剂的加入来实现快速检测培养液颜色的变化，进而推算结核分支杆菌的抗生素敏感情况，一般药敏培养三天后即可观察到药敏培养液的变化。其原理如下:将结核分枝杆菌在不同药物浓度下培养，同时向培养基里添加细胞代谢指示剂即alamar blue指示剂，在结核分支杆菌对抗体不敏感的情况下，细胞代谢旺盛，细胞内NADPH/NADP、FADH/FAD、FMNH/FMN和NADH/NAD的比值升高，处于还原环境。摄入细胞内的染料被这些代谢中间体及细胞色素类还原后释放到细胞外并溶于培养基中，使培养基从无荧光的靛青蓝变成有荧光的粉红色。最后用普通分光光度计或荧光光度计进行检测或目视，吸光度和荧光强度与活性细胞数有关。将检测结果与空白对照孔比较，来判断该结核分支杆菌对该药物的敏感情况。

目测液体培养液的颜色，如果培养液的颜色与空白对照的颜色接近即培养液由紫蓝色变为淡粉红色说明该株结核分支杆菌耐药，如果培养液的颜色无变化则说明对抗生素敏感；用分光光度计检测培养液的吸光度，如果培养液的吸光度与空白对照的接近说明该株结核分支杆菌耐药，如果培养液的吸光度比空白对照的大则说明对抗生素敏感；用荧光检测仪检测培养液的荧光强度，如果培养液的荧光强度与空白对照的接近说明该株结核分支杆菌耐药，如果培养液的荧光强度比空白对照的小则说明对抗生素敏感。

本发明进一步通过免疫磁珠的吸附作用分离和纯化结核分支杆菌，将富集的病人标本直接加入药敏培养试剂里，然后进行药敏试验，通过免疫磁珠的富集纯化作用，基本上可将传统的分离纯化时间由20-30天缩短为1-2天。

本发明相对于现有技术，有以下优点:

采用本发明的试剂盒及结果分析方法可较传统的方法在阳性检出率上有很大提高，在得出结果时间上大大提前，整个试验在3天内能够得出结果。

(四)具体实施方式: