[发明专利]利用质谱技术对苏云金杆菌菌株进行分类鉴定的方法

权利要求书

1.利用质谱技术对苏云金杆菌菌株进行分类鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)培养苏云金杆菌菌株直到晶体和芽胞从母细胞中完全释放，并将菌株芽胞/伴胞晶体混合物进行提纯；(2)通过包埋苏云金杆菌菌株产生的晶体蛋白混合物于聚丙烯酰胺凝胶块中，结合LC-MS/MS分析胶内酶解的复合肽段，鉴定晶体蛋白中原毒素的组成：将酶解好的肽段溶解在33μL含0.1％甲酸的水溶液中，13200rpm离心15min，取30μL至ESI-Trap的样品瓶中，进行CapLC-MS/MS分析；所有测定均在正离子模式下进行；用Glu-fib的串联碎片进行校正，质量误差为士0.1u,雾化气为氮气，碰撞气为氩气，源温为80℃，锥孔电压为45V，喷嘴电压3000V，MCP检测器电压为2700V；仪器的MS和MS/MS的转换通过仪器控制软件中的Automated Data Dependent Acquisition模式控制；自动进样系统设备装备一个C18脱盐预柱和一个C18毛细管柱；在进样后的前5min通过预柱脱盐和浓缩，流速250nL/min；以后的时间通过梯度洗脱经C18毛细管柱进行肽段分离，流速为200nL/min；流动相A液为含0.1％甲酸/4.9％ACN/95％的水溶液，B液为含0.1％甲酸/4.9％H₂O/95％ACN(v/v/v)；样品在预柱中用C液脱盐后，分析柱用以下梯度进行梯度洗脱：5-40min B液浓度从5％上升至50％，40-50min B液浓度从50％上升至95％，50-60min，B液浓度保持在95％，60-70minA液平衡分析柱；分离后的肽段直接进入离子源，一次选择三个最大强度的肽段进行MS/MS分析；(3)对于准确鉴定的新蛋白，以其鉴定的多肽氨基酸序列为依据，根据密码子反向推测其基因序列，并以此为模板设计引物；对该菌株总DNA进行PCR扩增，并克隆PCR产物，获得新蛋白的基因序列；根据该序列进一步扩增到后期的全长序列，并进行表达，进一步准确鉴定新蛋白，确定苏云金芽孢杆菌新菌株的分类地位。