[发明专利]利用质谱技术对苏云金杆菌菌株进行分类鉴定的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种苏云金杆菌菌株分类鉴定方法，具体地说，是涉及一种利用质谱技术对 苏云金杆菌菌株进行分类鉴定的方法。

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种广泛分布的革兰氏阳性细 菌，属于蜡质芽胞杆菌属。杀虫晶体蛋白是苏云金芽胞杆菌在芽胞形成的同时产生的伴胞晶 体的主要组成成分，对节肢动物门中鳞翅目(Lepidoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、双翅目 (Diptera)等10个目的昆虫和原生动物门(Protozoa)、扁形动物门(Platghelminthes)、 线形动物门(Nemathelminthes)等农林害虫有特异毒杀作用。伴胞晶体进入敏感昆虫的消化 道后发生溶解并释放出27-140kD的原毒素。在中肠蛋白酶的作用下，原毒素被激活为23-70 kD的毒性多肽。随后毒素与中肠刷状缘膜泡(BBMV，Brush border membrane vesicle)发 生作用并且在细胞膜上形成孔道，破坏细胞的渗透平衡，引起细胞裂解，最终导致幼虫死亡。

自Schnepf等首次从Bt菌株中克隆cry基因至今，已有400多种杀虫晶体蛋白被报道。 1989年，Hfte和Whiteley根据当时已报道的42个杀虫晶体蛋白的氨基酸序列的同源性和 杀虫谱的差异，提出了HW分类系统，即将Bt杀虫晶体蛋白分为两大类，晶体蛋白基因家族 (crystal protein genes)，即Cry蛋白，包括CryI、CryII、CryIII、CryIV和细胞外溶解 性晶体蛋白家族(cytolytic protein)，即Cyt蛋白。随着Bt分子生物学研究的深入，新 的cry基因不断被分离、克隆，有些Cry蛋白适合原有的HW系统，但是更多的Cry蛋白则不 适合这个分类系统。为解决这个问题，1995年，在无脊椎动物病理学年会上成立了由 N.Crickmore等组成的杀虫晶体蛋白及基因命名委员会，由此委员会提出了新的分类系统， 即所有来自苏云金芽胞杆菌的具有杀虫活性的晶体蛋白只根据ICPs氨基酸序列同源性的差 异，而不再考虑杀虫谱的不同来命名。同源性在45％以下的杀虫晶体蛋白，采用阿拉伯数字 来命名，如Cry1、Cry2；同源性在45％-78％之间，采用大写英文字母命名，如Cry1A、Cry1B； 同源性在78％-95％之间，采用小写英文字母命名，如Cry1Ac、Cry1Ab；同源性在95％以上， 也使用阿拉伯数字，如Cry1Aa1、Cry1Aa2。编码杀虫晶体蛋白的基因以相应的斜体并小写首 字母命名，如cry1Ac1。至2007年，Bt的杀虫晶体蛋白基因种类已经扩充到56群，100多 个亚群。目前，该系统还在继续扩大。

苏云金芽胞杆菌因为含有丰富的杀虫晶体蛋白而成为目前生物农药的主要生产菌株，菌 株和杀虫蛋白的鉴定是很有必要的(发现新菌株、新蛋白)。对其进行蛋白质组学分析，有助 于研究苏云金芽胞杆菌发酵过程中对晶体蛋白形成有重要影响的相关蛋白。Bt菌株以其产生 的杀虫晶体蛋白为主要杀虫活性成分，所以鉴定Bt菌株的晶体蛋白组成有助于全面准确地预 测其杀虫活性。目前对Bt杀虫晶体蛋白的鉴定主要是通过免疫印迹和高效液相色谱 (High-Performance Liquid Chromatography，HPLC)进行的。但是采用液相色谱和免疫印 迹鉴定Bt原毒素组成均存在耗时长的缺点，如液相色谱需要提供标准品，因此检测的前提是 构建目的蛋白的表达株并获得该蛋白的纯样品，而免疫印迹也需要获得纯化的目的蛋白，并 免疫兔子等动物，获得抗血清。此外，因为Bt原毒素在三级水平有78％以上的序列同源性， 也限制了液相色谱和免疫印迹等传统方法在原毒素鉴定上的应用。

随着质谱技术的发展，质谱方法的优势逐渐应用于各个生物组织的蛋白质组学分析。 2002年，Ranasinghe等运用SDS-PAGE串联基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析并鉴定了HD1-Dipel菌株产生的Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac和Cry2Aa原毒素，HD73 菌株产生的Cry1Ac；am2菌株产生的Cry1Hb、Cry1Db原毒素等晶体蛋白组分，初次显示了质 谱技术在Bt原毒素鉴定上的优势。2006年，Lee等采用SDS-PAGE结合ESI-Q-TOF分析了Bt konkukian亚种的晶体蛋白组成，虽然鉴定到了两种膜蛋白，但没有鉴定到杀虫晶体蛋白。