[发明专利]一种饲料有效磷测定方法

权利要求书

1、一种饲料有效磷测定方法，包括如下步骤：

(1)胃蛋白酶消化：准确称取待测饲料样品，放入玻璃试管中，加入适量胃蛋白酶溶液振荡摇匀，用palafilm胶密封，在水浴中恒温培养；

(2)胰蛋白酶消化：将经胃蛋白酶消化后的食糜与胰蛋白酶溶液混匀，用palafilm胶密封，继续在水浴中恒温培养；

(3)外翻肠囊的制作：参照Seal和Heaton(1983)的方法，用生理盐水将具有生理活性的猪十二指肠冲洗干净，剪成约5cm的肠段，小心将肠段外翻后，先结扎肠囊的一端，然后向浆膜腔内注入不含磷的Tris-Krebs缓冲液，结扎肠囊的另一端，即成外翻肠囊；

(4)磷的体外吸收：将外翻肠囊放入已进行(1)、(2)酶饲料样品消化的试管中，加入缓冲液，覆盖外翻肠囊并摇匀，继续在水浴中恒温培养；

(5)磷的测定：将肠囊取出，用不含磷的Tris-Krebs缓冲液将肠囊表面冲洗干净后，放入干净的坩埚中，于105℃下烘24小时，烘干后，将坩埚放入马福炉中灼烧8小时，溶解灰分，采用钼蓝法测定灰分中的总磷含量。

2、根据权利要求1所述的饲料有效磷测定方法，其特征在于：所述的

(1)胃蛋白酶消化：准确称取1g待测饲料样品，放入20mL玻璃试管中，加入胃蛋白酶溶液振荡摇匀，用palafilm胶密封，在39℃的水浴中恒温培养75min；

(2)胰蛋白酶消化：将经胃蛋白酶消化后的食糜与胰蛋白酶溶液混匀，用palafilm胶密封，继续在39℃的水浴中恒温培养270min；

(3)外翻肠囊的制作：用生理盐水将十二指肠冲洗干净，剪成约5cm的肠段，小心将肠段外翻后，先结扎肠囊的一端，然后向浆膜腔内注入2mL不含磷的Tris-Krebs缓冲液，注入2mLTris-Krebs缓冲液后，结扎肠囊的另一端，即成外翻肠囊；

(4)磷的体外吸收：将外翻肠囊放入已进行饲粮(1)、(2)酶消化的试管中，加入5mLTris-Krebs缓冲液，覆盖外翻肠囊并摇匀，继续在39℃的水浴中恒温培养40min；

(5)磷的测定：将肠囊取出，用缓冲液将肠囊表面冲洗干净后，放入干净的坩埚中于105℃下烘24小时，烘干后，将坩埚放入马福炉中灼烧8小时，溶解灰分，将所得样品采用钼蓝法测定其中总磷含量。

3、根据权利要求1所述的饲料有效磷测定方法，其特征在于：所述步骤(1)及(2)进行饲料磷模拟动物体内消化；所述步骤(3)、(4)、(5)进行外翻肠囊体外培养。

4、根据权利要求1所述的饲料有效磷测定方法，其特征在于：Tris-Krebs缓冲液的组成：Tris 15.5mmol/L；NaCl 120.7mmol/L；KCl 5.6mmol/L；CaCl₂2.5mmol/L水合MgCl₂1.2mmol/L；葡萄糖11.5mmol/L。

5、根据权利要求1所述的饲料有效磷测定方法，其特征在于：胃蛋白酶消化时，胃蛋白酶溶液为750U/mL+0.18mol/LHCl。