[发明专利]一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测的方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测的方法。

背景技术

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)感染而引起的一种全球性传染病。据估计目前全世界有1.7亿丙肝病毒感染者，我国的丙肝感染率大约为3.0％，目前至少有4000～6000万丙肝患者。其中有80～85％的感染者将发展为慢性丙型肝炎，其中又有20％可发展为肝纤维化，最终有4～5％的肝纤维化患者发生肝细胞性肝癌，危害十分严重。

目前，尚无针对丙型肝炎病毒的特效治疗药物，丙型肝炎疫苗的研制也因HCV快速变异而困难重重，短期内难有突破进展。因此，HCV的早期诊断对于筛查HCV传染源、指导临床治疗和预后判断有重大意义。

现有HCV常用检测方式主要有：(1)间接检测：用来检测体内抗HCV抗体，由于HCV感染后到抗HCV抗体的出现有一个约40～70天的“窗口期”，所以抗HCV不能作为HCV感染的早期诊断指标；(2)直接检测：通过定性或定量检测HCV病毒粒子的组成成分以确定病毒的存在。由于HCV感染后6～15天感染者血液中即有HCV-RNA的出现，并在血清阳转之前达到一个较高的水平，因此采用该检测技术对献血员进行常规筛选可以大大降低“窗口期”感染的危险，虽然定性或定量检测HCV病毒粒子的方法具有早期、敏感和特异等特点，但由于该技术需要昂贵精密的仪器、较高的实验技巧、昂贵的试剂，且容易导致交叉污染导致假阳性偏高，导致其很难推广到单个献血员，在发展中国家的应用也受到很大程度的限制。

鉴于以上HCV病毒检测方法的局限性，尽快研制出快速、准确、低廉并在各大医院可普及的HCV检测方法成为必要。目前尚未有对HCV抗体和HCV核心抗原的联合检测，从而使HCV感染的“窗口期”大大缩短的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对HCV核心抗原和HCV抗体联合检测的方法，使HCV感染的″窗口期″缩短至2周，从而达到准确、快速、便捷的检测目的。

为实现上述目的，本发明的方法包括如下步骤：

1)通过计算机分析丙型肝炎病毒不同亚型的核心抗原序列，确定2个高度保守、抗原性强的氨基酸序列：QDVKFPGGGQIVGGVY、PRGSRPSWGPTDPRRR，再通过基因工程技术克隆表达HCV的全序列抗原，纯化重组HCV-cAg并进行活性鉴定；

2)利用单克隆抗体技术制备2株高效分泌特异性抗HCV核心抗原的鼠源杂交瘤细胞株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为CCTCCNO：C200823、CCTCC NO：C200824，进行抗体纯化得到高比活的抗HCV核心抗体；

3)酶结合物制备：将冻干的辣根过氧化物酶纯化后，与制备的单抗混合使其形成酶结合物，再对酶结合物进行双重纯化并浓缩，-20℃保存备用；

4)重构HCV核心抗原和其它非结构蛋白的嵌合抗原：所述的嵌合抗原通过以下方式制备：根据HCV全基因序列设计合成8条引物，用PCR分片段克隆NS-3，NS-4、NS-5和Core核心的相应基因片段，构建重组载体并转化大肠杆菌诱导表达蛋白，表达产物用亲和层析进行纯化再采用Western blot法鉴定活性。

所述8条引物分别为：

①HCV-core-F：TTG CTC GAG AGG CGA CAA CCT ATC C；

②HCV-core-R：GGC GGA GAC GGG CAG TCG GGG TGA CAG GAG；

③HCV-NS3-F：CTC CTG TCA CCC CGA CTG CCC GTC TCC GCC；

④HCV-NS3-R：GCT ATC AGC CGG TTC ATG TCT ACA TTG GTG TAC；

⑤HCV-NS4-F：GTA CAC CAA TGT AGA CAT GAA CCG GCT GAT AGC；

⑥HCV-NS4-R：GGA GTA CGA CTC AAC CTG GGT AAC ACG CGC；

⑦HCV-NS5-F：GCG CGT GTT ACC CAG GTT GAG TCG TAC TCC；

⑧HCV-NS5-R：CAC TCG GGC ACA GGG AAG TTT GGC CTT GAC。

5)包被酶联板并检测：将以上制备的抗HCV cAg的单克隆抗体和嵌合抗原同时包被酶联板，加入待测样品进行检测。