[发明专利]细胞疾病靶标的负选择

权利要求书

1.在宿主细胞中鉴定促进调节元件活性的基因组序列的方法，其 包括确定在暴露于筛选剂后仍存活的宿主细胞中表达的小发夹RNA分 子的多核苷酸序列，其中：

(a)所述细胞经改造含有表达效应子蛋白的表达盒，在所述细胞 暴露于所述筛选剂时所述效应子蛋白具有细胞毒性，

(b)将编码所述效应子蛋白的序列与促进该效应子蛋白表达的调 节元件可操作性连接，和

(c)用至少一种表达小发夹RNA分子的载体转化所述细胞，其中 所述小发夹RNA分子：

(i)具有与宿主细胞基因组序列互补的多核苷酸序列，和

(ii)靶向具有上述基因组序列的核酸由此阻止该基因组序列的表 达，

其中所述小发夹RNA分子的互补多核苷酸序列的身份指示了宿主 细胞的所述基因组序列，当宿主细胞中不存在该小发夹RNA时所述基 因组序列将促进所述表达盒调节元件的活化。

2.权利要求1的方法，其中编码所述效应子蛋白的序列是编码单 纯疱疹病毒胸苷激酶的效应子基因。

3.权利要求2的方法，其中所述筛选剂是更昔洛韦。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述效应子基因与诱导其表 达的调节元件可操作性连接。

5.权利要求4的方法，其中所述调节元件选自：启动子、增强子 元件、铁调节元件(IRE)、5’非翻译区、反式作用元件和顺式作用元件。

6.权利要求4或5的方法，其中所述调节元件选自：病毒、细菌或 真菌调节元件。

7.权利要求4至6中任一项的方法，其中所述调节元件是乙肝病毒 Pre-S1启动子。

8.权利要求1-7中任一项的方法，其中宿主细胞是哺乳动物细胞。

9.权利要求8的方法，其中所述哺乳动物细胞是癌细胞。

10.权利要求9的方法，其中所述癌细胞选自：HepG2、Huh7和 HEK293。

11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述表达盒联合编码小发 夹环RNA分子文库。

12.权利要求1-11中任一项的方法，其中转化所述宿主细胞包括用 慢病毒表达载体转染宿主细胞。

13.权利要求12的方法，其中所述慢病毒表达载体是来源于EIAV、 FIV、BIV、CAEV或MVV的非灵长类慢病毒表达载体。

14.权利要求1-13中任一项的方法，其中确定(E)中多核苷酸序 列的步骤包括对有效应子抗性的已转化宿主细胞的核酸提取物进行 PCR扩增反应。

15.产生分离的对效应子有抗性的转化宿主细胞的方法，其包括：

(A)改造宿主细胞以包含效应子基因，其中当筛选剂存在时所述 效应子基因的表达对所述宿主细胞有细胞毒性；

(B)用编码小发夹RNA分子的表达盒转化(A)的宿主细胞群， 其中每个所述小发夹RNA分子具有与宿主细胞基因组的多核苷酸序列 互补的序列；

(C)通过在一定条件下使(B)中的所述转化宿主细胞群接触所 述筛选剂来选择存活的至少一种有效应子抗性的转化宿主细胞，所述条 件为其中所述转化宿主细胞表达至少一种由所述表达盒编码的小发夹 RNA分子并且其中效应子基因的表达杀伤对效应子敏感的转化宿主细 胞但不杀伤所述至少一种有效应子抗性的转化宿主细胞；和

(D)分离(C)中的所述至少一种有效应子抗性的转化宿主细胞， 由此产生分离的有效应子抗性的转化宿主细胞。

16.权利要求15的方法，其中所述效应子基因是单纯疱疹病毒胸苷 激酶。

17.权利要求16的方法，其中所述筛选剂是更昔洛韦。

18.权利要求15-17中任一项的方法，其中所述效应子基因与诱导 其表达的调节元件可操作性连接。