[发明专利]细胞疾病靶标的负选择

说明书

技术领域

本发明涉及使用基于RNAi的负筛选测定对参与活化调节元件之基 因的鉴定。

发明内容

本发明的一个方面是鉴定宿主细胞中促进调节元件之活性的基因 组序列的方法，其包括确定在经暴露于筛选剂后仍存活的宿主细胞中表 达的小发夹RNA分子的多核苷酸序列，其中(a)所述细胞经改造而含 有表达效应子蛋白的表达盒，该效应子蛋白在所述细胞暴露于所述筛选 剂时变成有细胞毒性，(b)编码该效应子蛋白的序列与促进所述效应子 蛋白表达的调节元件可操作性连接，和(c)用至少一种表达小发夹RNA 分子的载体转化所述细胞，其中所述小发夹RNA分子(i)具有与宿主 细胞基因组序列互补的多核苷酸序列，和(ii)靶向具有上述基因组序 列的核酸并由此阻止该基因组序列的表达，其中所述小发夹RNA分子 的互补多核苷酸序列的身份指示了宿主细胞的所述基因组序列，当宿主 细胞中缺少该小发夹RNA时所述基因组序列促进所述表达盒中调节元 件的活化。

本发明的另一个方面是鉴定靶基因的方法，其包括(A)改造宿主 细胞以包含效应子基因，其中在筛选剂存在时所述效应子基因的表达对 宿主细胞是有细胞毒性的；(B)用编码小发夹RNA分子的表达盒转化 (A)的宿主细胞群，其中每个所述小发夹RNA分子具有与宿主细胞 基因组的多核苷酸序列互补的序列；(C)通过在一定条件下用所述筛选 剂与(B)中所述的已转化宿主细胞群体相接触来选择至少一种抗效应 子的存活的已转化宿主细胞，其中所述已转化宿主细胞表达至少一种由 所述表达盒编码的小发夹RNA分子，并且其中所述效应子基因的表达 杀伤对效应子敏感的已转化宿主细胞但不杀伤所述至少一种对效应子 有抗性的已转化宿主细胞；(D)分离(C)中所述的至少一种对效应子 有抗性的已转化宿主细胞；(E)确定与由(D)中所分离的抗效应子的 已转化宿主细胞表达的所述小发夹RNA分子互补的多核苷酸序列；和 (F)将由(E)中确定的由所述对效应子有抗性的已转化宿主细胞表达 的所述至少一种小发夹RNA分子互补的多核苷酸序列与所述宿主细胞 基因组的至少一个多核苷酸序列进行比较，以鉴定包含所述多核苷酸序 列的宿主基因，其中该多核苷酸序列与由所述抗效应子的已转化宿主细 胞表达的至少一种小发夹RNA分子互补，从而鉴定作为该宿主细胞中 靶基因的宿主细胞基因。

在一个实施方案中，所述效应子基因是单纯疱疹病毒胸苷激酶。

在另一个实施方案中，所述筛选剂是更昔洛韦(ganciclovir，GCV)。

在一个实施方案中，所述效应子基因与诱导其表达的调节元件可操 作性连接。在一个实施方案中，所述调节元件选自：启动子、增强子元 件、铁调节元件(iron regulatory element，IRE)、5’非翻译区、反式作 用元件和顺式作用元件。在又一个实施方案中，所述调节元件选自：病 毒、细菌或真菌调节元件。在一个实施方案中，所述调节元件是乙肝病 毒Pre-S1启动子。

在另一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案 中，所述哺乳动物细胞是癌细胞。在另一个实施方案中，所述癌细胞选 自：HepG2、Huh7和HEK293。

在又一个实施方案中，所述表达盒联合编码小发夹环RNA分子文 库。

在一个实施方案中，转化所述宿主细胞包括用慢病毒表达载体转染 宿主细胞。在一个实施方案中，所述慢病毒表达载体是非灵长类慢病毒 表达载体，其来源于EIAV、FIV、BIV、CAEV或MVV。

在所述方法的一个实施方案中，确定(E)中多核苷酸序列的步骤 包括对有效应子抗性的已转化宿主细胞的核酸提取物进行PCR扩增反 应。