[发明专利]花生β-酮脂酰-ACP合成酶Ⅱ基因及其编码蛋白质

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，特别涉及花生β-酮脂酰-ACP合成酶II基因及其分离的方法，以及通过生物信息学方法分析和预测其编码蛋白的功能部位和理化性质。

背景技术

β-酮脂酰-ACP合成酶II是催化16:0-ACP到18:0-ACP，即从棕榈酸到硬脂酸转化过程的关键酶，并且在不同植物组织以及不同发育阶段都起着重要的调控作用，也是植物胚胎发育所必需的酶类(Halozaki H.，Park J.，Endo M.et al.Expression and development function of the 3-ketoacyl-ACP synthase2 gene inArabidopsis thaliana[J].Genes Genet.Syst，2008，83：143-152)。目前已从拟南芥、甘蓝型油菜、大豆等多种植物中获得β-酮脂酰-ACP合成酶II基因片段(Carlsson，A.S.，LaBrie，S.T.，Kinney，A.J.，et al.A KAS2 cDNA complements thephenotypes of the Arabidopsis fabl mutant that differs in a single residue borderingthe substrate binding pocket[J].Plant Journal 2002，29(6)，761-770)；Aghoram，K.and Dewey，R.E.A mutation in a 3-Keto-Acyl-Acyl Carrier Protein Synthase II(KASII)Gene is Associated with Elevated Palmitate Levels in SoybeanLines Carrying thefap2 Mutation[J].unpublished；Kinney，A.J.Acyl-ACP condensing enzymes fromcanola[J].unpublished)。但目前国内外对此基因的相关研究很少，花生中尚没有此基因的相关报道。cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends，RACE)是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5′和3’末端的有效方法。本发明采用RACE技术首次获得了花生籽粒中β-酮脂酰-ACP合成酶II全长基因。同时，通过生物信息学方法对其编码蛋白质的性质进行预测，为下一步该基因在花生中的表达研究以及通过提高该基因表达量改良花生品质的研究奠定了基础。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种花生β-酮脂酰-ACP合成酶II基因及其分离方法。

本发明所提供的β-酮脂酰-ACP合成酶II，从花生(Arachis hypogaea)中克隆，命名为AhKAS II基因，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

上述花生β-酮脂酰-ACP合成酶II(AhKAS II)的克隆方法，包括如下步骤：

A.设计引物：根据NCBI数据库中的序列信息设计目的基因的简并引物Kas-5A(5′-ATGGGTTCTGCTATGCTTGC-3′)和Kas-3A(5′-ACCACCAAACCCGAATGAAT-3′)。

B.花生总RNA的获得：以SPI056花生种子作为实验材料，采用Pbiozol植物组织RNA提取试剂盒提取花生种子中的总RNA。RNA含量及质量采用琼脂糖凝胶电泳检测；

C.目的基因cDNA片段的获取：以获得的总RNA为模板，采用SMARTTMRACE Amplification Kit(Clontech)，反转录合成5’-和3’RACE-Ready cDNA。以5’-RACE-Ready cDNA为模板，进行目的基因片段的PCR扩增。反应程序如下：94℃预变性3min，94℃变性45s，53℃复性50s，72℃延伸60s，30个循环后，72℃延伸10min；