[发明专利]溴氰菊酯多克隆抗体酶联免疫检测方法及其应用

权利要求书

1、一种溴氰菊酯多克隆抗体酶联免疫检测方法，其特征在于： 所述方法为利用溴氰菊酯半抗原(DM)和牛血清白蛋白(BSA)的 偶联物(DM-BSA)免疫健康白兔得到多克隆抗体，筛选后以溴氰菊 酯为标准品，以DM和鸡卵清白蛋白(OVA)的偶联物(DM-OVA) 作为包被抗原，建立食品中溴氰菊酯农药的间接竞争酶联免疫法。

2、根据权利要求1所述的溴氰菊酯多克隆抗体制备方法，其特 征在于多克隆抗体的制备步骤为：

(1)实验动物：4月龄雄性新西兰大白兔，体重约2kg；

(2)免疫方法：第1周耳缘静脉采血约1mL，备用。首次基础 免疫用弗氏完全佐剂0.4mL与0.4mL抗原DM-BSA充分混合，背部 皮内多点注射；2周后进行加强免疫，弗氏不完全佐剂0.5mL与0.5mL 抗原DM-BSA充分混合，背部皮下多点注射。2周后进行二次加强免 疫，弗氏不完全佐剂0.6mL与0.6mL抗原DM-BSA充分混合，背部 皮下多点注射。2周后进行三次加强免疫，弗氏不完全佐剂0.7mL与 0.7mL抗原DM-BSA充分混合，背部皮下多点注射。每次免疫间隔2 周；

(3)采血：四免后，耳脉静脉采血间接ELISA法测定抗血清效 价，达到2×10⁴后，心脏采全血，分离抗血清。

3、根据权利要求1所述的溴氰菊酯酶联免疫检测方法，其特征 在于酶联免疫检测具体步骤为：

(1)加抗原：用包被缓冲液以体积比1∶1600稀释人工抗原 (DM-OVA)后，加入96孔酶标板中，每孔加100μL，37℃孵育3h； 按照常规ELISA法封闭洗涤；

(2)加抗体：用样品稀释液以体积比1∶1600稀释抗体后，与标 准品(或样品)等体积混合，每孔加100μL，37℃孵育30min后洗涤 液(PBST)洗涤4次；

(3)加酶标二抗：用样品稀释液以体积比1∶1000稀释辣根酶标 记的山羊抗兔IgG后，每孔加100μL，37℃孵育30min后PBST洗涤 4次；

(4)加显色液：每孔加显色液100μL，37℃避光显色15min；

(5)加终止液：每孔加终止液100μL；

(6)测定：酶标仪490nm测吸光度OD值。

4、一种如权利要求1-3之任一所述的溴氰菊酯酶联免疫检测方 法的应用，其特征在于：所述检测方法应用于实际食品样品检测，具 体步骤为：将溴氰菊酯溶于甲醇，再分别加至一定量的食品中，使溴 氰菊酯在食品中的浓度为0.1mg.kg^-1、0.5mg·kg^-1和1mg.kg^-1，再分 别加入体积比为4∶1的正己烷和乙酸乙酯混合溶剂，超声萃取，过 滤，滤液浓缩至干，再用10％甲醇的样品稀释液溶解后供ELISA测 定。