[发明专利]溴氰菊酯多克隆抗体酶联免疫检测方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种农药残留检测方法及其应用，更具体地说是用酶 联免疫吸附方法(ELISA)检测食品中溴氰菊酯的残留。

背景技术

溴氰菊酯(Deltamethrin)

溴氰菊酯(Deltamethrin)是我国用量最大的拟除虫菊酯类农药，具 有用药量小，药效快，毒性相对低等优点，被广泛应用于农业、林业、 公共卫生等，但它的高频次使用导致了该类农药在作物体及其农副产 品中的残留水平较高，造成了环境污染，破坏了生态平衡，直接或间 接危及到了人类的健康，若人们经常性摄入含有该类农药残留的水 果、蔬菜、茶叶等农副产品，极易造成慢性或亚慢性中毒。因此，各 国对溴氰菊酯在农副产品中的残留监控也愈来愈严，一些国家制定了 严格的限量标准，致使我国出口的农产品屡屡发生被拒收、扣留、退 货等事件，造成了巨大的经济损失。因此，建立一种快速准确的溴氰 菊酯检测方法是迫在眉睫之事。

在此背景下，具有高特异性和灵敏度的免疫分析技术近年蓬勃发 展起来，该技术可避免复杂分析样本中杂质的干扰，并简化前处理的 步骤。

溴氰菊酯是小分子化合物(分子量＜1000)，本身不具有诱导产 生抗体的能力，因此，建立溴氰菊酯ELISA检测方法的第一步是合成 具有免疫原性和抗原性的人工完全抗原，该人工抗原本实验室已设计 完成，并获得了国家专利，名称为“一种溴氰菊酯人工抗原的合成方 法及测定方法”，申请号为200610144966.8。在此基础上，本发明利 用已合成的人工抗原免疫动物，得到针对溴氰菊酯的多克隆抗体，对 该抗体进行特性鉴定的同时，建立优化了溴氰菊酯的ELISA检测方 法。

多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为制备高效价和高特异性 的多克隆抗体，必须要有理想的免疫原、适宜的动物及切实可行的免 疫方法。酶联免疫技术是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相 结合而建立的一种新技术，根据检测目的、试剂来源和实验条件，可 设计出多种类型的方法，因此，选择适合的ELISA检测方法也是建立 农药快速免疫分析技术的关键所在。

目前，国内关于溴氰菊酯免疫分析技术的研究仍处于初步阶段， 尚无快速检测方法建立。本发明建立的溴氰菊酯ELISA检测技术具有 灵敏度高、方便快捷、分析容量大、分析费用低、仪器化程度要求不 高等特点，便于推广，若把这种技术转化为试剂盒，可商品化大规模 生产，具有很好的经济效益和社会效益。

发明内容

1、发明目的

本发明的目的在于提供一种溴氰菊酯多克隆抗体酶联免疫检测 方法及其应用，它是一种快速检测食品中溴氰菊酯农药残留的酶免疫 学方法，使样品无须经过繁琐的提纯或浓缩步骤，并且保证较高的敏 感性及特异性。

2、技术方案

本发明的技术方案如下：

本发明一种溴氰菊酯多克隆抗体酶联免疫检测方法，所述方法为 利用溴氰菊酯半抗原(DM)和牛血清白蛋白(BSA)的偶联物 (DM-BSA)免疫健康白兔得到多克隆抗体，筛选后以溴氰菊酯为标 准品，以DM和鸡卵清白蛋白(OVA)的偶联物(DM-OVA)作为包 被抗原，建立食品中溴氰菊酯农药的间接竞争酶联免疫法。

具体地，多克隆抗体的制备步骤为：

(1)实验动物：4月龄雄性新西兰大白兔，体重约2kg；

(2)免疫方法：第1周耳缘静脉采血约1mL，备用。首次基础 免疫用弗氏完全佐剂0.4mL与0.4mL抗原DM-BSA充分混合，背部 皮内多点注射；2周后进行加强免疫，弗氏不完全佐剂0.5mL与0.5mL 抗原DM-BSA充分混合，背部皮下多点注射。2周后进行二次加强免 疫，弗氏不完全佐剂0.6mL与0.6mL抗原DM-BSA充分混合，背部 皮下多点注射。2周后进行三次加强免疫，弗氏不完全佐剂0.7mL与 0.7mL抗原DM-BSA充分混合，背部皮下多点注射。每次免疫间隔2 周；

(3)采血：四免后，耳脉静脉采血间接ELISA法测定抗血清效 价，达到2×10⁴后，心脏采全血，分离抗血清。

酶联免疫检测具体步骤为：

(1)加抗原：用包被缓冲液以体积比1∶1600稀释人工抗原 (DM-OVA)后，加入96孔酶标板中，每孔加100μL，37℃孵育3h； 按照常规ELISA法封闭洗涤；