[发明专利]双歧杆菌冷冻浓缩发酵剂及其制备方法

权利要求书

1.一种双歧杆菌冷冻浓缩发酵剂的制备方法，其特征在于它包括下列步骤：

A.双歧杆菌菌种扩大培养与双歧杆菌发酵培养

双歧杆菌菌种为双歧杆菌属长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、短双歧杆菌或两歧双歧杆菌；

①菌种活化试管培养

将培养基pH调至6.0～7.5，在0.05Mpa～0.14Mpa湿热灭菌15min～30min后备用；

在菌种活化前，将低温保存的双歧杆菌安瓿瓶在室温下放置2h～3h，然后在无菌室将安瓿瓶用75％浓度的酒精棉球擦拭表面消毒，打开安瓿瓶，用无菌吸管吸取0.2ml～0.3ml的培养基加入安瓿瓶内，将安瓿瓶内菌物，按体积百分比为2％～5％的接种量接种于培养基中，试管培养，在厌氧条件下30℃～42℃培养20h～48h后，终止培养；以相同接种量、培养条件再连续活化2次，获得3代液体培养物；

②三角瓶一级菌种培养

取试管培养3代液体培养物，按体积百分比为2％～5％的接种量，接入三角瓶进行一级菌种液体培养，在厌氧条件下30℃～42℃培养20h～48h后，终止培养；

③种子罐二级菌种培养

取三角瓶一级菌种液体培养物，按体积百分比为2％～5％的接种量，接入种子罐进行二级菌种液体培养，在普通条件下30℃～42℃培养20h～48h后，终止培养；

④发酵罐培养

将经种子罐二级菌种培养的液体培养物，按体积百分比为2％～5％的接种量，接入发酵罐，在30℃～42℃培养，当发酵液pH低于5.5时，用NaOH溶液调节发酵液pH至6.0～6.5之间，培养20h～48h后停止培养；

B.菌体离心收集

设置离心机温度0℃～8℃，离心转速3000r/min～9000r/min、离心时间10min～30min，离心结束后除去上清液，收集沉淀的双歧杆菌菌体备用；

C.添加保护剂

将离心收集的菌体悬浮于离心前发酵罐培养液原体积1/10～1/2的保护剂中；

D.真空包装

用灭菌过的复合铝薄袋，盛装添加保护剂后的离心收集菌体，真空度≤0Mpa后，封口；

E.冷冻贮藏：测定添加保护剂后的离心收集菌体共晶点，以低于共晶点温度5℃～30℃的条件冷冻贮藏双歧杆菌发酵剂，最终得到双歧杆菌冷冻浓缩发酵剂；

C步骤添加的保护剂选自保护剂配方1～保护剂配方4中的一种，

保护剂配方1的组成和重量配比为：脱脂牛奶或脱脂奶粉5～30份、甘油0.5～5份和水100份；保护剂在0.05Mpa～0.14Mpa湿热灭菌15min～30min，

保护剂配方2的组成和重量配比为：脱脂牛奶或脱脂奶粉5～30份、甘油0.5～5份、蔗糖3～10份和水100份，保护剂在0.05Mpa～0.14Mpa湿热灭菌15min～30min，

保护剂配方3的组成和重量配比为：脱脂牛奶或脱脂奶粉5～30份、甘油0.5～5份、L-半胱氨酸盐酸盐或抗坏血酸0.1～1份和水100份，保护剂中脱脂牛奶或脱脂奶粉和甘油及水在0.05Mpa～0.14Mpa湿热灭菌15min～30min，保护剂中L-半胱氨酸盐酸盐和抗坏血酸采用过滤除菌，

保护剂配方4的组成和重量配比为：脱脂牛奶或脱脂奶粉5～30份、甘油0.5～5份、L-半胱氨酸盐酸盐或抗坏血酸0.1～1份、蔗糖3～10份和水100份；保护剂中脱脂牛奶或脱脂奶粉、甘油和蔗糖及水在0.05Mpa～0.14Mpa湿热灭菌15min～30min，保护剂中L-半胱氨酸盐酸盐和抗坏血酸采用过滤除菌。

2.根据权利要求1所述的双歧杆菌冷冻浓缩发酵剂的制备方法，其特征在于：C步骤中保护剂的添加量为离心前发酵罐培养液原体积的1/3～1/5。

3.由权利要求1或2所述的方法制备的双歧杆菌冷冻浓缩发酵剂。