[发明专利]双歧杆菌冷冻浓缩发酵剂及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种双歧杆菌冷冻浓缩发酵剂及其制备方法。

背景技术

双歧杆菌是人体内的正常生理性细菌，定殖于肠道内，是肠道的优势菌群，其数量的多少与人体健康密切相关，是目前公认的一类对机体健康有促进作用的代表性有益菌。双歧杆菌的主要生理功能有：1.生物屏障和生物拮抗作用；2.增强免疫和抗肿瘤作用；3.营养作用；4.抑制内毒素的产生；5.廷缓机体衰老等。随着年龄的增长、环境污染及抗生素的使用等影响，该菌在人体肠道内的数量逐渐下降，从而造成肠道内微生态平衡破坏，导致各种疾病衰老的发生。

向肠道内补充双歧杆菌最直接的途径就是体外培养同源双歧杆菌，以活菌制剂作为食品、保健品或药品使用。双歧杆菌的数量及其活性被作为检验产品质量的重要指标，由于双歧杆菌是专性厌氧菌，对氧气非常敏感，且不耐酸，在氧气和酸度较低的条件下，生长缓慢且容易死亡，造成培养的难度大，生产的成本高，给双歧杆菌生产带来很大困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种双歧杆菌冷冻浓缩发酵剂及其制备方法，以解决双歧杆菌不易培养，发酵剂活力低，保存期短的问题。

本发明双歧杆菌冷冻浓缩发酵剂的制备方法，包括下列步骤：

A.双歧杆菌菌种扩大培养与双歧杆菌发酵培养

双歧杆菌菌种为双歧杆菌属长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium brevis)或两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)；以上菌种购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)，编号AS 1.2186。婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)，编号AS1.2202。青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)，编号AS 1.2891。短双歧杆菌(Bifidobacterium brevis)，编号AS 1.2213。两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidus)编号AS 1.2212。

①菌种活化试管培养

将培养基pH调至6.0～7.5，在0.05Mpa～0.14Mpa湿热灭菌15min～30min后备用；

在菌种活化前，将低温保存的双歧杆菌安瓿瓶在室温下放置2h～3h，然后在无菌室将安瓿瓶用75％浓度的酒精棉球擦拭表面消毒，打开安瓿瓶，用无菌吸管吸取0.2ml～0.3ml的培养基加入安瓿瓶内，将安瓿瓶内菌物，按2％～5％(体积百分比)的接种量接种于培养基中，试管培养，在厌氧条件下30℃～42℃培养20h～48h后，终止培养；以相同接种量、培养条件再连续活化2次，获得3代液体培养物；

②三角瓶一级菌种培养

取试管培养3代液体培养物，按2％～5％(体积百分比)的接种量，接入三角瓶进行一级菌种液体培养，在厌氧条件下30℃～42℃培养20h～48h后，终止培养；

③种子罐二级菌种培养

取三角瓶一级菌种液体培养物，按2％～5％(体积百分比)的接种量，接入种子罐进行二级菌种液体培养，在普通条件下30℃～42℃培养20h～48h后，终止培养；

④发酵罐培养

将经种子罐二级菌种培养的液体培养物，按2％～5％(体积百分比)的接种量，接入发酵罐，在30℃～42℃培养，当发酵液pH低于5.5时，用NaOH溶液调节发酵液pH至6.0～6.5之间，培养20h～48h后停止培养；

B.菌体离心收集

设置离心机温度0℃～8℃，离心转速3000r/min～9000r/min、离心时间10min～30min，离心结束后除去上清液，收集沉淀的双歧杆菌菌体备用；

C.添加保护剂

将离心收集的菌体悬浮于离心前发酵罐培养液原体积1/10～1/2的保护剂中；保护剂的添加量优选1/3～1/5。

D.真空包装

用灭菌过的复合铝薄袋，盛装添加保护剂后的离心收集菌体，真空度≤0Mpa后，封口；

E.冷冻贮藏：测定添加保护剂后的离心收集菌体共晶点，以低于共晶点温度5℃～30℃的条件冷冻贮藏双歧杆菌发酵剂，最终得到双歧杆菌冷冻浓缩发酵剂。