[发明专利]一种双层人工皮肤及其制备方法

权利要求书

1.一种双层人工皮肤，包含有成纤维细胞，其特征在于，其是由脱细胞膜状生物衍生材料作为表层，由成纤维细胞及其合成分泌的细胞外基质和细胞生长因子复合于生物支架材料内部形成真皮层，两者嵌合构成；所述的脱细胞膜状生物衍生材料为天然生物组织经脱细胞所形成的膜状生物医用材料，包括脱细胞小肠粘膜下层、脱细胞真皮基质、脱细胞筋膜、脱细胞膀胱粘膜下层、脱细胞羊膜、脱细胞硬脑膜的任一种；所述的成纤维细胞包括可向成纤维细胞分化的干细胞；所述的生物支架材料是能为细胞生长提供三维空间的支撑材料，包括纤维蛋白原、纤维蛋白、海藻酸盐、胶原蛋白、透明质酸、硫酸软骨素、壳聚糖、水凝胶、明胶、聚乳酸、聚羟基乙酸的任一种或是几种的混合。

2.制备权利要求1所述的双层人工皮肤的方法，包括有细胞获取、脱细胞生物衍生材料制备的步骤，其特征在于，具体步骤如下：

步骤1).成纤维细胞的获取：人成纤维细胞按常规的培养方法进行体外培养和大规模扩增；

步骤2).脱细胞生物衍生材料的制备：采用皮肤真皮层、筋膜、小肠粘膜下层、羊膜、硬脑膜的任一种膜状生物材料制备；将材料置于含有过氧乙酸和乙醇的水溶液中浸泡消毒不低于1小时，用磷酸盐缓冲液清洗后；将其置于NaOH溶液浸泡处理；用磷酸盐缓冲液浸洗至pH中性，再将其置入含有DNA酶和α-半乳糖苷酶的混合溶液中处理25分钟以上，用磷酸盐缓冲液浸洗后在其上均匀制孔，再将无孔的与有孔的脱细胞生物衍生材料叠加压紧使其紧密结合，干燥灭菌后成为双层脱细胞生物衍生材料；

步骤3).双层人工皮肤培养液的配制，其组分按体积百分比包括有：商用最低必需培养液DMEM 67.5％、商用培养液F12为22.5％、胎牛血清5～15％，碱性成纤维细胞生长因子2～100ng/ml、表皮细胞生长因子2～100ng/ml、胰岛素1～50ng/ml、氢化可的松10～500ng/ml、腺嘌呤0.2～0.25mM和   转铁蛋白1～10μg/ml；

步骤4). 双层人工皮肤的构建：先配制生物支架材料的凝胶溶液；将制备的双层脱细胞生物衍生材料浸透凝胶溶液后，置于37℃环境下预固化；将体外培养的成纤维细胞按10⁴～10⁶个/ml的浓度混合于凝胶溶液中，再按0.1～1ml/cm²滴加到预固化材料的有孔面上，置于5％CO₂环境中37℃条件下固化；再置入双层人工皮肤培养液中培养2～3天后，将其置于培养器皿内的培养支架上继续培养5～8天，培养期间每天换液，培养完成；上述的培养条件均为37℃，5％CO₂环境。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中在所述脱细胞生物衍生材料制孔的孔径为0.1～1mm，间距为0.5～5mm。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤2)中所述的过氧乙酸和乙醇的体积终浓度分别为0.1～0.5％和2～10％；所述DNA酶和α-半乳糖苷酶的终浓度分别为30～50U/ml和10～25U/ml。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤2)中所述的浸泡消毒清洗后，NaOH溶液浸泡前，将材料置于-80℃冷冻半小时以上，取出后自然解冻，如此反复冻融2～5次，用磷酸盐缓冲液清洗后再于NaOH溶液浸泡。