[发明专利]一种双层人工皮肤及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于组织工程的生物材料技术领域，具体涉及一种双层人工皮肤及其制备方法。 

背景技术

皮肤是覆盖和保护体表的重要组织器官。由于炎症、溃疡、外伤、烧伤、肿瘤术后以及先天性畸形等原因常造成皮肤的缺损和异常。对于这种组织缺损目前多采用自体皮肤移植的方法，这不仅造成供皮区新的创伤缺陷，而且经常受到供皮来源的限制。 

随着组织工程技术的发展，制备人工皮肤已成为皮肤缺损治疗的热点。理想的组织工程化皮肤能够模仿天然皮肤的结构，具有表皮层和真皮层的复合型皮肤。其中的真皮层成分与皮肤真皮的成分接近，利于真皮细胞的长入；表皮层覆盖物起到隔离外界环境，防止水分蒸发，避免细菌入侵，同时复合一些生长因子或者药物，可以起到促进创面愈合、治疗皮肤疾病的目的。 

目前已商品化的双层人工皮肤有Integra(Integra LifeSciences公司生产)，为双层基质的人工皮肤，真皮部分由牛肌腱的胶原蛋白及硫酸软骨素制成具有一定孔洞大小的支架，表皮层则由硅胶膜组成，可以控制伤口水气的蒸散，在伤口愈合过程，真皮层会与伤口结合，表皮层的硅胶膜可以在真皮层愈合后去除，再进一步做自体皮肤移植，美国FDA已在1996年核准Integra在烧烫伤治疗使用；其不足主要在于，由于其表面有不可降解的胶膜，不易观察创面早期的感染情况，不利于创缘表皮细胞的爬行和创面的封闭，后期揭掉硅胶膜还需要二次手术。Apligraf(Organogenesis公司生产)也是双层的人工皮肤，真皮层是由人类真皮成纤维细胞种植在牛胶原蛋白中，表皮层是由人表皮细胞构成，附着在真皮上形成表皮层；其不足主要在于表皮层是由免疫原性较高的异体表皮细胞构成，增加了产品的免疫排斥反应，同时使得生产工艺复杂、生产时间长、成本增加。 

发明内容

本发明的目的就是提供一种双层人工皮肤及其制备方法，具有制备周期短、成本低、方法简便、易于操作的优点；所制备的人工皮肤具有止血、防止体液流失、保护创面并促进创面愈合的功能，有良好的生物相容性，能用于修复皮肤缺损、控制创面感染、治疗难愈性的创面，同时还具有形状、大小和厚度能根据需求制备的优点。 

本发明提出的双层人工皮肤，包含有成纤维细胞，其特征在于：是由脱细胞膜状生物衍生材料作为表层，由成纤维细胞及其合成分泌的细胞外基质和细胞生长因子复合于生物支架材料内部形成真皮层，两者嵌合构成；所述的脱细胞膜状生物衍生材料为天然生物组织经脱细胞处理后所形成的膜状生物医用材料，包括脱细胞小肠粘膜下层、脱细胞真皮基质、脱细胞筋膜、脱细胞膀胱粘膜下层、脱细胞羊膜、脱细胞硬脑膜的任一种；所述的成纤维细胞为自体或异体来源的成纤维细胞，或可向成纤维细胞分化的干细胞，包括骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、造血干细胞、皮肤干细胞、间充质干细胞、肌肉干细胞，肝脏干细胞、神经干细胞的任一种；所述的生物支架材料是能为细胞生长提供三维空间的支撑材料，包括纤维蛋白原、纤维蛋白、海藻酸盐、胶原蛋白、透 明质酸、硫酸软骨素、壳聚糖、水凝胶、明胶、聚乳酸、聚羟基乙酸的任一种或是几种的混合。 

本发明所述的双层人工皮肤的制备方法，包括有成纤维细胞的获取、脱细胞生物衍生材料的制备以及双层人工皮肤的构建，具体步骤如下： 

步骤1).成纤维细胞的获取：人成纤维细胞按常规的细胞培养方法进行体外培养，细胞的大规模扩增可采用已有的方法进行； 

步骤2).脱细胞生物衍生材料的制备：将取自同种或异种的皮肤真皮层、或筋膜、或小肠粘膜下层、或羊膜、或硬脑膜的任一种膜状生物材料，置于含有过氧乙酸和乙醇的水溶液中浸泡消毒不低于1小时，用磷酸盐缓冲液(PBS溶液)清洗；(若是采用较厚的生物材料，如皮肤真皮层，此时需置于-80℃冷冻半小时以上，确保材料内外温度达到一致，取出后自然解冻，如此反复冻融2～5次，使细胞完全破裂崩解，用PBS溶液清洗)；将其置于0.1～1M的NaOH溶液浸泡进行脱脂、脱细胞处理；用PBS溶液浸洗至pH中性，再将其置入含有DNA酶和α-半乳糖苷酶的混合溶液中，37℃环境下处理25分钟以上，去除残留的DNA和α-gal天然抗原成分，降低免疫原性，用PBS溶液清洗；为了使其与支架材料结合牢固，采用机械方法在其材料上均匀制孔，孔径0.1～1mm，间距0.5～5mm，将无孔的脱细胞生物衍生材料与有孔的脱细胞生物衍生材料叠加压紧使其紧密结合，干燥灭菌后成为双层脱细胞生物衍生材料，备用；