[发明专利]用于筛选退色剂的色素化皮肤类似物模型及其构建方法

权利要求书

1.一种可筛选退色剂的色素化皮肤类似物模型，其特征在于，由体外培养的皮肤成纤维细胞与鼠尾I型胶原构建真皮类似物层，在其上复合角质形成细胞、黑色素细胞后构建而成，所述的成纤维细胞、角质形成细胞和黑色素细胞是从人包皮组织分离后经扩大培养而获取的；成纤维细胞是以2×10⁵/ml～3×10⁵/ml与浓度为20％的鼠尾I型胶原混合后凝固形成真皮类似物层后，再将角质形成细胞1.0×10⁷/ml与黑色素细胞0.3×10⁷/ml接种于真皮类似物层上。

2.一种如权利要求1所述的可筛选退色剂的色素化皮肤类似物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)组织工程皮肤种子细胞来源、分离、培养：

a)手术切除的人包皮组织0.25％洗必泰溶液中浸泡；

b)2.5g/L的Dispase II酶消化包皮组织，分离表皮、真皮；

c)真皮组织剪切成1×1×1mm³大小的组织块，放入培养瓶中，30min后，待成纤维细胞迁移出组织块，扩增培养成纤维细胞；

d)表皮组织置于2.5g/L胰蛋白酶中消化后，离心，置于黑色素细胞培养液中，培养扩增黑色素细胞；

e)将成纤维细胞培养于含胶原的培养瓶中，形成成纤维细胞滋养层，表皮组织置于2.5g/L胰蛋白酶中消化后，离心置于含滋养层的培养瓶中，加入KGM-G3F培养液中培养扩增角质形成细胞；

(2)构建可筛选退色剂的色素化皮肤类似物：

a)成纤维细胞以2×10⁵/ml～3×10⁵/ml的密度与浓度为20％的鼠尾I型胶原混合后凝固30分钟后，加入培养液培养一周，构建真皮类似物层；

b)在表面加入1.0×10⁷/ml的角质形成细胞与0.3×10⁷/ml的黑色素细胞置于transwell培养小室中培养，加入KGM-G3F培养液；

c)培养1周后进行气-液平面培养，继续培养2周后获得可筛选退色剂的色素化皮肤类似物模型。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于；所述的transwell培养小室为商用培养板；所述的成纤维细胞培养液成分为：DMEM商用培养液，15％小牛血清；所述的黑色素细胞培养液成分为：RMP1640商用培养，并含：碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)2～3×10⁴U/L，霍乱毒素(CT)0.20～0.25g/L，转铁蛋白5～10mg/L，小牛血清100～150ml/L，氢化考的松2～5mg/L，胰岛素100～150U/L，庆大霉素10～15万/L；所述的KGM-G3F培养液成分为：DMEM/F12(3∶1)商用培养液，并含100ml～150ml/L胎牛血清，腺嘌呤0.18～0.20mM，表皮生长因子EGF10～15ng/ml，氢化可的松0.4～0.50ug/ml，胰岛素3～5ug/ml，异丙肾上腺素10～15uM，转铁蛋白5～10ug/ml，三碘甲状腺氨酸2～3nM，氨卞青霉素100～120ug/ml，硫酸链霉素80～100ug/ml。