[发明专利]用于筛选退色剂的色素化皮肤类似物模型及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种可用于筛选退色剂的色素化皮肤类似物及其构建方法。

背景技术

整形外科手术常用皮片移植修复较大面积的皮肤缺损，术后移植区与周围皮肤颜色往往不同，多表现为色素沉着增加。近年来由于污染引起的环境和臭氧层的破坏，使得黑素形成酶出现代谢紊乱，引起患有雀斑、黄褐斑、老年斑等各种黑色斑症状的患者增多。因而治疗色素沉着过多等色素性疾病具有较高的社会效益和经济效益。如何解决色素问题，已成为整形外科医师及皮肤科医师研究的重要课题。

成熟的黑素细胞位于表皮细胞的基底层，是一种树突状细胞，每一个黑素细胞与周围大约36个角质形成细胞构成“表皮黑素单元”。生理情况下黑素细胞的增殖力较弱，基底层角质形成细胞和真皮成纤维细胞都可通过分泌一些生长因子或细胞外基质成分，对黑素细胞形态、黑素合成和转运等活动进行调节，角质形成细胞还可通过细胞间接触影响黑素细胞的行为。皮片等移植后的创面修复中，不仅毛囊中角质形成细胞迁移，毛囊外根鞘中的黑素细胞亦被激活，而在激活和移行中某个环节发生异常，并且局部炎性介质的改变，可能是导致色素沉着的原因。黑素是一种含氮的复合物，在黑素细胞的特有器官-黑素小体中合成。皮肤颜色的不同主要由于优/褐黑素比例的不同、在角质形成细胞中的分布、黑素细胞的活性以及黑素小体的大小、数量、分布、环境等因素决定。

由于皮肤是个由多种细胞构成的器官，除了角质形成细胞，朗格汉斯细胞、成纤维细胞等都可影响黑素单元及黑素细胞的功能，其中角质形成细胞、成纤维细胞在调节黑素细胞生长、形态、色素化及分化方面起着积极的作用。自黑素细胞体外培养成功以来，人们对退色剂的研究进入了快速发展阶段。由于这种方法具有能方便、快速筛选退色剂的优点，已成为当前研究退色剂的主要方法。然而由于培养的细胞系及培养条件的不同，实验结果出入较大。如有些实验使用的细胞系是人或哺乳动物的黑素瘤细胞，而肿瘤细胞的信号传导途径及对外界刺激的反应均与正常体细胞有很大的不同；有些实验虽采用正常人表皮黑素细胞，但培养基中添加的分裂原是12-0-十四烷酰佛波醇-13-乙酯(TPA)，而TPA是一种强促癌剂，因此采用安全、稳定并接近体内环境的培养系，将更具有说服力。

近年来用于研究黑素细胞及评估各种影响黑素细胞因素的模型很多，但它们与皮肤结构相差较大，随着生物工程技术的进步及人们研究的深入，逐步发展了以气-液平面技术来培养色素化皮肤，因此构建与皮肤更相近的模型，将为黑素细胞体外生物学的研究、退色剂的筛选提供了更为理想的模型，以期为临床应用治疗色素沉着等色素性疾病提供实验方法和理论依据。

发明内容

为了克服上述现有技术不足，本发明提供一种用于筛选退色剂的色素化皮肤类似物模型及其构建方法，更接近正常皮肤，可为筛选美白退色剂提供一种理想的皮肤类似物模型。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明一种可筛选退色剂色素化皮肤类似物，由体外培养的皮肤成纤维细胞与胶原构建真皮类似物层，在其上复合角质形成细胞、黑色素细胞后构建而成。所述的成纤维细胞、角质形成细胞和黑色素细胞是从人包皮组织分离后经扩大培养而获取的；成纤维细胞是以2×10⁵/ml～3×10⁵/ml与浓度为20％的鼠尾I型胶原混合后凝固形成真皮类似物层后，再将角质形成细胞(1.0×10⁷/ml)与黑色素细胞(0.3×10⁷/ml)接种于真皮类似物层上。

本发明构建方法包括有灭菌、消化、分离、培养，包括以下步骤：

(1)组织工程皮肤种子细胞来源、分离、培养：

a)手术切除的人包皮组织0.25％洗必泰溶液中浸泡；

b)2.5g/L的Dispase II酶消化包皮组织，分离表皮、真皮；

c)真皮组织剪切成1×1×1mm³大小的组织块后，置于成纤维细胞培养液中扩增培养成纤维细胞；

d)表皮组织置于2.5g/L胰蛋白酶中消化后，离心，置于黑色素细胞培养液中，培养扩增黑色素细胞；

e)将成纤维细胞培养于铺满鼠尾I型胶原的培养瓶中，形成成纤维细胞滋养层，分离表皮组织置于2.5g/L胰蛋白酶中消化后，离心置于含滋养层的培养瓶中，加入KGM-G3F培养液中培养扩增角质形成细胞；

(2)构建可筛选退色剂的色素化皮肤类似物：