[发明专利]阴离子聚合物接枝涂层毛细管及用于蛋白质在线富集分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及制备阴离子聚合物接枝涂层毛细管及其蛋白质在线富集毛细管电泳分析 方法，属于蛋白质分离分析技术领域。

背景技术

蛋白质的分离分析无论在医疗诊断领域还是在日益发展的蛋白质组学研究领域均具 有十分重要的意义。毛细管电泳(capillary electrophoresis)技术因其具有高柱效、 高选择性、低消耗、易于自动化等优点，已广泛的用于蛋白质的分离分析。毛细管电泳一 般在内径为25～100微米的石英毛细管内进行，故溶质的进样量较小。此外，蛋白质毛细 管电泳一般使用紫外检测器进行在线检测，因此检测光程较短。所以，毛细管电泳法检测 灵敏度较差，溶质检测限较高。如何有效的提高毛细管电泳法的检测灵敏度及降低溶质检 测限是当今毛细管电泳研究及应用领域的热点问题。

迄今，解决这一问题主要有三种方法：(1)改变与紫外检测器连接处毛细管柱的光路 设计，如安捷伦公司研制的带有泡型检测池(bubble cell)的毛细管柱；(2)采用具有 较高灵敏度的检测器如荧光检测器，质谱检测器等；(3)采用样品富集方法，这种方法又 分为在线富集(on-line preconcentration)及离线富集(off-line preconcentration) 两种。其中第一种方法虽然可以在一定程度上提高检测灵敏度，但是所用的毛细管柱往往 价格较高。第二种方法往往需要毛细管电泳仪额外配备价格昂贵的检测器，此外，这种方 法对样品或缓冲液均有特殊的要求，进而限制了其广泛应用。第三种方法中离线富集方法 虽然可以使样品得到较大程度上的富集，但是这种方法往往需要富集柱同分离柱偶联起来 使用，操作比较麻烦。

样品在线富集方法是当今解决毛细管电泳检测灵敏度差的主要方法，也是当今研究的 热点问题。迄今，许多在线富集方法已用于蛋白质的毛细管电泳分析。其中，样品堆积方 法(sample stacking method)是最常使用的方法。Bessonova等在《journal of chromatography A》第1150卷中报道了采用五中样品堆积富集方法对人血清白蛋白(HAS) 进行毛细管电泳分离分析(Electrophoretic determination of albumin in urine using on-line concnetration techniques，Journal of Chromatography A，2007，1150， 332-338)。其中采用大体积样品堆积方法(large volume sample stacking method)使 HSA的检测灵密度提高了67倍，样品检出限为：15μg/ml。使用这种方法样品的进样量 最多为一倍柱体积。然而对于极低浓度的样品，一倍柱体积的进样量也往往无法得到具有 较强信号的溶质吸收峰。因此，这种方法不适用于极低浓度样品的分析检测。

在线样品萃取富集方法(on-line sample extraction and preconcentration method) 可以通过多倍柱体积样品进样实现对样品的高倍富集。Li等用带有负电溶胶凝胶涂层管柱 对肌红蛋白进行了在线萃取富集分离(Negatively charged sol-gel column with stable electroosmotic flow for online preconcentration of zwitterionic biomolecules in capillary electromigration separations，Journal of separation science，28， 2153-2164)。肌红蛋白在进样的过程中通过静电作用吸附在毛细管内壁上，随后用大于肌 红蛋白等电点的缓冲液在正向电渗流的推动下将吸附的蛋白洗脱下来。该法对肌红蛋白的 富集倍数达3000倍。然而，这种方法每次只可以富集分离一种蛋白质，不适用于蛋白质 混合物的分离分析。