[发明专利]一种采用静息细胞的雄烯二酮生物发酵方法

权利要求书

1.一种微生物静息细胞降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮转化工艺，步骤如下：

具有降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮的微生物菌种的静息细胞可直接或经适当处理后，加入到植物甾醇转化液中进行第一次静息细胞转化反应，使转化液中的植物甾醇转化得到雄烯二酮/雄二烯二酮转化结束后，去除菌体细胞，将转化液经溶剂提取得到雄烯二酮/雄二烯二酮。

2.如权利要求1所述，其特征在于第一次静息细胞转化反应结束后，被去除的菌体细胞可以直接或经适当处理后，加入到第二批植物甾醇转化液中进行第二次静息细胞转化反应，使转化液中的植物甾醇转化得到雄烯二酮/雄二烯二酮后，去除菌体细胞，将转化液经溶剂与第一次静息细胞的转化液合并，通过溶剂提取得到雄烯二酮/雄二烯二酮。

3.如权利要求2所述，其特征在于第一次静息细胞转化反应时间不超过45小时。

4.如权利要求1所述，其特征在于微生物静息细胞的制作工艺为将具有降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮的微生物菌种接种到培养液中，培养结束后，将培养液与菌体分离，所获菌体沉淀作为静息细胞。

5.如权利要求1所述，其特征在于微生物静息细胞的制作工艺为将具有降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮的微生物菌种接种到含植物甾醇的培养液中，进行植物甾醇微生物转化发酵培养，同时不断添加底物植物甾醇到转化发酵培养液中，维持植物甾醇浓度在0.1％以上，转化发酵培养结束后，将转化发酵培养液与菌体分离，所获转化发酵培养液经溶剂提取，得到雄烯二酮/雄二烯二酮，所获菌体沉淀作为静息细胞。

6.如权利要求3或4所述，其特征在于静息细胞培养所使用的培养基为每升培养基含有玉米浆或Refiner糖蜜、无机盐，还可以增加糖，其中优选玉米浆，无机盐可以优选磷酸铵和硝酸钠，其比例优选磷酸铵∶硝酸钠为10∶40-99，糖优选葡萄糖，静息细胞可以用磷酸缓冲液洗涤。

7.如权利要求1所述，其特征在于植物甾醇可以进行粉碎或与溶剂混合后缓慢与转化液混合，便于植物甾醇与静息细胞接触。

8.如权利要求1所述，其特征在于微生物菌种的静息细胞直接或经适当处理加入到植物甾醇转化液中，直接使用是指是微生物培养结束后，直接从培养液经离心或过滤获得的菌体沉淀；使用经适当处理是指前述的菌体沉淀经40-90℃加热处理一段时间后所获得的死菌体；或是指前述的菌体沉淀经任意一种已知的固定化方法处理所获得的固定化菌体；或是指前述的菌体沉淀，通过细胞自溶、或细胞破碎等方法使酶释放到溶液中，通过离心或过滤等方法除去菌体细胞碎片后，所得的细胞酶提取液，或经硫酸按盐析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法等纯化后的酶制剂。

9.如权利要求1-8所述，其特征在于具有降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮的微生物菌种为分支杆菌。

10.如权利要求9所述，其特征在于降解植物甾醇得到雄烯二酮/雄二烯二酮的微生物菌种为NRRL B-3683，NRRL B-3805，NRRL B-8153。