[发明专利]一种采用静息细胞的雄烯二酮生物发酵方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种新的关于雄烯二酮及雄二烯二酮发酵工艺。本发明一种以所述雄甾化合物为活性成分的药物制剂及该雄甾化合物在制备治疗人或哺乳动物疾病的药物中的应用。

发明内容

雄甾4-烯-3，17-双酮(androst-4-ene-3，17-dione，简称：雄烯二酮或AD)是甾体激素类药物不可替代的中间体，对机体起着非常重要的调节作用。可以说几乎所有甾体激素药物都是以AD作为起始原料进行生产的。如用于生产性激素、孕激素、蛋白同化激素及皮质激素，又可用于合成氢化可的松，氧化泼尼松，黄体酮、雌烯醇、地塞米松等100余种药物，也是直接用于生产抗早孕米非司酮和各类计划生育用药的必不可少的基本原料。如今AD不断被一些发达国家用于开发和生产新的医药主品，如福美司坦(Formestane或Lentaron)，等及类固醇类激素免疫抗原等，目前全世界范围内，AD的应用领域日益拓宽，用AD做原材料生产的医药品种不断增加。

由于化学全合成雄烯二酮成本较高，国内外很多科学家一直研究如何通过生物发酵方法得到雄烯二酮。50年代，美国Upjohn公司首先利用侧链上有双链的大豆甾醇和麦角甾醇为原料生产出雄甾-4-烯-3，17二酮(AD)及雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)并以此作为合成甾体药物的原料。近年来，由于甾体药物应用量逐年增加，人们的目光又转到在动植物界中含量较多的胆甾醇，谷甾醇，菜油甾醇等，并被认为是具有巨大潜能的甾体激素类药物的起始原料。20世纪60年代中期，由Sih等首先发现有些微生物可以选择性降解切除甾醇的饱和侧链而得到AD和ADD，70年代初，日本的有马启利用微生物降解胆甾醇生产ADD获得成功，受到许多制药公司的高度重视。为了大量生产类固醇激素，研究者试图使用甾醇为唯一碳源分离微生物和改变甾醇结构用作发酵的底物，并用能防止甾醇核降解的化学添加剂来提高类固醇的收得率，这一努力已获得很大进展(Marsheck等，Aplied Microobiology，23(1)：72～77，1972)。此外，埃及国家研究中心生物与天然产品化学系的和Sallam等研究发现，利用磷酸盐缓冲液调节底物培养基pH值5.5～7.38可提高生物降解AD、ADD的转化率。由于AD与ADD结构非常类似，两者的混合物分离较为困难，而且在使用中AD的用途远多于ADD，AD也可以通过生物法得到ADD，所以科学家更希望通过控制生物转化，减少ADD的含量，更多得到高含量的AD。Upjohn公司在美国专利No.4,293,644中描述了一种通过分枝杆菌(ATCC 29472)的突变株从多种类固醇中得到以高产量的雄-4-烯-3，17-二酮(AD)为主，并有少量雄-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)的产物的方法。以后的研究发现节杆菌，诺卡氏菌和分枝杆菌等微生物均可用于直接切除甾醇的饱和侧链，在一定条件下得到AD和ADD，这使得微生物转化工业化生产成为可能。近年来该工艺主要是通过菌种的改造，提高收率和含量，如WO9949075A1公开了一种植物甾醇向雄烯二酮(AD)和雄二烯二酮(ADD)的微生物转化方法，并具体公开以下技术特征：利用一种培养基增殖分枝杆菌属的分枝杆菌MB3683菌种；利用一种或多种增溶剂将植物甾醇组合物溶解成溶液；将分枝杆菌MB3683培养物和植物甾醇组合物溶液置于生物反应器中，并保持足够的时间，将植物甾醇组合物转化为AD和/或ADD。

以上工艺基本上采取生长细胞培养转化法，即是在微生物细胞培养前或培养一段时间后，将底物直接加到微生物培养基中，微生物在自身繁殖生长的同时对底物进行生物转化。这是生物转化法最简单和最常用的一种方法。该法的优点是微生物生物转化容易，缺点是产品的后发酵时间长，易产生多种产物，处理分离纯化困难。如CN03804973中说明按照1％的投料浓度时，植物甾醇转化为AD/ADD的时间在87-91小时，而且AD/ADD的比例一般为9/1。如果降低底物的投料浓度，反应时间可以缩短，但相应工业化成本会大大提高。