[发明专利]一种快速检测抑菌物质活性的微孔板生物检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域抑菌物质产生菌株的选育，特别涉及一种快速检测抑菌物质抑菌活性的微孔板检测方法。

背景技术

抑菌物质可以从环境中分离得到的天然菌株包括原核生物、真核生物产生，或者基因工程菌通过发酵产生或从天然产物中直接提取，目前，通常用高效液相色谱法和生物检测法对其进行检测。

高效液相色谱法常用于准确定量样品的浓度，而不能直接得到反映样品抑菌活性高低的最小抑菌浓度(MIC)。此外，该法对设备和耗材的要求比较高、分析时间长、不适合大规模样品的检测。

生物检测法是利用抑菌物质与敏感菌之间的拮抗作用，主要的方法有滤纸片法、管碟法和比浊法。滤纸片法是将经过高温灭菌的滤纸浸入含有抑菌物质的待测样品液中，沥干溶剂后平贴于涂有指示菌的平板上，培养一定时间后与对照组比较测定抑菌圈的大小，从而确定抑菌物质的含量。管碟法是将无菌不锈钢小杯置于事先涂有指示菌的平板中，并向杯中加入一定量测试液，培养一定时间后，与对照组比较，确定抑菌物质含量。这两种方法都是通过抑菌圈的大小来反映抑菌物质活性的高低，操作过程繁琐、每次平板上测定的样品数目有限，一般为4-10个，在大规模样品处理时容易受人为因素的影响，灵敏度和可靠性较差。比浊法是将待测样品加入指示菌的液体培养集中，培养一定时间后测定培养液浊度值的大小，并与对照组进行比较以确定其含量。该方法需要对每个样品分别检测，耗时较长、且存在着样品加入和检测时间不同带来的误差，也不适合大批量样品的快速检测。

因此，有必要建立一种快速、简便、准确测量的新方法对抑菌物质的活性进行检测。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种快速检测抑菌物质抑菌活性的微孔板检测方法。该方法是利用待测样品对敏感指示菌具有较高的抑菌特性，以具有良好标准化和平行化特点的微孔板作为高通量的检测平台，将敏感菌指示液和待测样品在微孔中充分混合并培养适宜的时间后，通过酶标仪测定微孔板各孔中培养液浊度的变化对样品的抑菌活性进行快速检测。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种快速检测抑菌物质活性的微孔板生物检测方法，其检测方法的步骤是：

(1).将经过活化培养的敏感指示菌制成浓度为10⁵-10⁹cfu/mL菌悬液；

(2).将菌悬液接种到无菌的敏感菌液体培养基中，制成浓度为10⁴-10⁸cfu/mL敏感菌指示液；

(3).利用多道移液器，向微孔板各孔中加入100-750μL敏感菌指示液，培养0-12h后，通过多道移液器继续加入5-50μL待测的抑菌物质，并反复抽吸使之与敏感菌指示液充分混合；

(4).培养4-24h后，用酶标仪在550nm～660nm下检测各孔中培养液的OD值，并计算出各孔中样品的抑菌率。

而且，所述敏感指示菌是原核生物，或真核生物。

而且，所述敏感指示菌的原核生物是大肠杆菌(Escherchia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aruginosa)或结核杆菌(Corynebacteriumtuberclousis)，所述敏感指示菌的真核生物是酵母菌(Saccharomyces)或念珠菌(Monilia)。

而且，所述微孔板各孔的容量为300-1000μL，微孔形状为方形或圆形，孔底形状为平底或圆底，为96孔板，或者是48孔板、24孔板。

而且，所述敏感指示液加入到微孔板后的培养方式和其与待测样品在各孔中充分混合后的培养方式可以是静置培养，或者振荡培养。

而且，所述抑菌物质是从环境中分离得到的天然菌株包括原核生物、真核生物产生，或基因工程菌通过发酵产生；或从天然产物中直接提取。

而且，所述产生抑菌物质的原核生物是细菌(bacteria)、放线菌(Streptomyces)、粘细菌(Myxobacteria)或假单胞菌(Pseudomonas)，所述产生抑菌物质的真核生物的是霉菌(mould)、念珠菌(Monilia)或酵母菌(Saccharomyces)，所述的天然抑菌物质为天然产物中提取，例如黄酮类物质，壳聚糖类物质。

而且，所述抑菌率的计算公式如下：