[发明专利]一种抗农药溴氰菊酯的特异性抗体

权利要求书

1.农药溴氰菊酯的人工抗原和抗体其特征在于使用分子式为

的6-{[3-(2，2-二溴-乙烯基)-2，2-二甲基-环丙基羰基]-氨基}-己酸作为半抗原与血蓝蛋白连接合成人工抗原，与辣根过氧化物酶连接合成酶标抗原，其中人工抗原再经过免疫新西兰大白兔，取血，分离出抗血清纯化制得抗体

2.权利要求1所述的农药溴氰菊酯人工抗原的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得：

(1)合成6-氨基己酸甲酯

称量400-410mg氨基己酸溶于4mL甲醇之中，冰浴下搅拌，缓慢滴加氯化亚砜，在冰浴下继续搅拌30min-40min，减压下脱去溶剂后即得6-氨基己酸甲酯；

(2)合成6-{[3-(2，2-二溴-乙烯基)-2，2-二甲基-环丙基羰基]-氨基}-己酸甲酯

称量二溴菊酯80-82mg溶解于6mL无水二氯甲烷中，冰浴搅拌反应30min；再依次加入1.0-2.0mg 4-二甲氨基吡啶和69-72mgN，N-二环己基碳二亚胺，氮气保护下室温搅拌4-5h；加入43-49mg 6-氨基己酸甲酯，搅拌，反应过夜，滤去反应液中沉淀，再依次使用0.1mol/L盐酸、饱和碳酸氢钠、蒸馏水和饱和氯化钠溶液洗涤即得6-{[3-(2，2-二溴-乙烯基)-2，2-二甲基-环丙基羰基]-氨基}-己酸甲酯；

(3)合成6-{[3-(2，2-二溴-乙烯基)-2，2-二甲基-环丙基羰基]-氨基}-己酸

称取128-130mg 6-{[3-(2，2-二溴-乙烯基)-2，2-二甲基-环丙基羰基]-氨基}-己酸甲酯溶于2.62mL无水乙醇中，边搅拌边滴加2mol/LNaOH溶液3.25mL，加热回流3h，然后除去乙醇，用盐酸酸化至pH 4，再加入氯仿使其溶解，减压去除溶剂即得溴氰菊酯半抗原；

(4)合成6-{[3-(2，2-二溴-乙烯基)-2，2-二甲基-环丙烷羰基]-氨基}-己酸-2，5-二氧吡咯烷-1-基酯

称量72-73mg 6-{[3-(2，2-二溴-乙烯基)-2，2-二甲基-环丙基羰基]-氨基}-己酸和25-26mgN-羟基硫代琥珀酰亚胺溶于2.2mL无水四氢呋喃，在氮气保护下加45-46mg N，N-二环己基碳二亚胺；室温反应过夜，过滤，除去溶剂，即得农药溴氰菊酯半抗原的活化酯；

(5)人工抗原的合成

取上述方法合成的半抗原活化酯1.6mg溶于2ml二甲基甲酰胺配成溶液A，0.86mg血蓝蛋白溶于2mlpH 7.4的0.2mol/L磷酸缓冲液配成溶液B，然后在冰浴下将溶液A缓慢的加入溶液B中，经搅拌后在4℃下反应过夜，最后将反应液置入透析袋中，在4℃下用pH 7.4的0.2mol/L磷酸缓冲液透析三天即可得到人工抗原。

3.权利要求1所述的农药溴氰菊酯酶标抗原的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得：

取上述方法合成的半抗原活化酯1.9mg溶于2ml二甲基甲酰胺配成溶液A，0.54mg辣根过氧化物酶溶于2ml pH 7.4的0.2mol/L磷酸缓冲液中配成溶液B，然后在冰浴下将溶液A缓慢的加入溶液B中，经搅拌后在4℃下反应过夜，最后将反应液置入透析袋中，在4℃下用pH7.4的0.2mol/L磷酸缓冲液透析三天即可得到酶标抗原，用于显色反应

4.权利要求1所述的农药溴氰菊酯抗体的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得：

免疫动物选用雌性新西兰大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后进行四次加强免疫，加强免疫分别于初次免疫后2周、4周和6周后免疫三次，此后间隔一个月，进行第五次免疫，9天后由兔子的耳缘静脉取血，进行效价检测，具体做法是：

初次免疫：取1mg按照权利要求2所述方法合成的人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏完全佐剂等体积所配制的溶液中，进行动物免疫；

加强免疫：用0.5mg上述人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏不完全佐剂等体积所配制的溶液，进行动物免疫；

抗体纯化：定时监测动物抗体效价，当抗体对一定的包被抗原达到适宜效价时，采集血液，并离心获得抗血清，使用G-Sepharose蛋白亲和层析柱对抗血清进行纯化，获得抗农药溴氰菊酯的特异性抗体。