[发明专利]一种抗农药溴氰菊酯的特异性抗体

说明书

技术领域

本发明属于农药小分子化合物(分子量小于1000道尔顿)免疫化学和残留分析技术领域：涉及有机合成，免疫化学，生物化学技术等，特别涉及具有二溴菊酸结构的农药溴氰菊酯小分子化合物人工半抗原合成和免疫动物特异性抗体制备及其在建立免疫分析方法方面的应用。

背景技术

拟除虫菊酯(Pyrethroids)是一类重要的仿生性杀虫剂，是国家提倡推广的农药产品，据专家预测，仿生农药仍将是21世纪新农药开发的热点。我国从20世纪70年代就开始对这类杀虫剂进行研制，它的合成和应用是继有机氯杀虫剂、有机磷杀虫剂、氨基甲酸酯杀虫剂之后的一个新突破，也是杀虫剂史上的第三个重要的里程碑。它是目前使用面积广、用量大的农用及卫生杀虫剂，占杀虫剂总产量的20％，占整个杀虫剂使用面积的25％。随着其使用量和品种的不断增加，这类农药的残留问题已引起人们的广泛关注。为此，对农药溴氰菊酯的残留限制也越来越严格。

目前对于溴氰菊酯农药检测的方法主要为气相色谱法、正相高效液相色谱法和微型层析柱净化毛细管气相色谱法。但这些方法都存在检测时间长，前处理复杂，消耗大量溶剂，需昂贵仪器等缺点，并且不能进行现场在线检测或跟踪监测。因此，迫切需要发明一种简便，快速，灵敏的检测方法。

酶联免疫吸附分析即ELISA法，它利用酶标记物同抗原抗体复合物的免疫反应与酶的催化放大作用相结合，即保持了酶催化反应的敏感性，又保持了抗原抗体的特异性，因而极大的提高了灵敏度。同时它又是一种非均相免疫分析，即在反应中的每一步都有洗涤过程，因而除去了未反应物质和干扰物质。

半抗原是指只有反应原性，不具免疫原性的物质，又称不完全抗原。通常，具有免疫原性的物质分子量应大于10000，而农药的分子量一般均小于1000，一般不能刺激机体产生针对农药抗原决定簇的特异性抗体，因此农药属于半抗原，必须与大分子载体偶联后才具有免疫原性，这也是小分子免疫分析的基本模式。半抗原的结构对抗体的特异性至关重要，半抗原分子的设计与合成是小分子免疫分析技术的关键所在。半抗原分子的设计应以农药亲体以及有毒理学意义的代谢产物的分子结构为目标化合物，针对被测定对象是单一农药或某一类农药，设计中应相应地突出特定农药的分子结构或一类农药中共有的基本分子构架(即母核)。对不具备活性基团的农药分子通常以直接衍生化或者以原料合成，也可用待测农药代谢或降解产物作为半抗原。对于某些分子太小和不稳定的农药，可合成其衍生化的半抗原。一般理想的半抗原分子应尽量具备与待测物类似的立体化学特征，以减少免疫交叉反应性，提高抗体的特异性；同时，要保证半抗原与载体的大分子复合后，半抗原的特征结构能最大限度地被免疫活性细胞所识别，以制备出具有预期选择性和高亲和力的抗体。

人工抗原是半抗原与大分子载体蛋白偶联得到的完全抗原。使用载体不是简单地增加半抗原的分子量，更重要的是利用其较强的免疫原性诱导机体产生免疫应答，从而使机体产生针对半抗原及人工抗原的特异性抗体。

免疫分析技术的关键是半抗原的分子设计，合成和人工全抗原及抗体的制备。因此，目标分析物分子免疫学特性，以及如何通过化学或生化技术突出和利用这些特性，是该领域重要的研究内容。

由于菊酯类农药同分异构体较多，制备特异性抗体较为困难，菊酯类农药的免疫快速检测一直是一个比较困难的问题。本发明的目的是通过设计合成具有二溴菊酸结构的农药溴氰菊酯的半抗原和人工抗原；独特之处在于突出了这类农药分子特异性抗原决定簇，又克服了化学合成的困难，免疫动物产生亲和性很高的特异性抗体；并以此为基础建立了快速免疫方法，准确检测农药溴氰菊酯。

发明内容

本发明设计合成了小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白质偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备对小分子分析物特异性抗体，利用抗原抗体的特异性免疫学反应和易被检测识别的标记物的放大作用，从而定性定量的检测样本中超微量小分子目标物，可用于样本测定。该技术研究的关键是半抗原的分子设计、合成和全抗原及抗体的制备。

溴氰菊酯的结构如图所示：

为了突出该农药分子特异性抗原决定簇，本发明选择二溴菊酸结构

为半抗原的基本结构，设计半抗原的结构。本发明的所设计的半抗原结构为

用此半抗原与载体蛋白连接合成人工抗原

与HRP连接合成酶标抗原

1农药溴氰菊酯半抗原的合成