[发明专利]养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗及制备方法

说明书

技术领域

本发明属于渔用疫苗领域，具体地涉及一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗及制备方法。

背景技术

养殖鲆鱼(包括大菱鲆和褐牙鲆)是我国海水工厂化主要养殖鱼类品种，养殖产量占到海水工厂化养殖鱼类产量的60％以上，经济效益显著。随着养殖规模的扩大，在养殖过程中出现了一种腹水病，其症状为：肝、肾肿大，腹部膨胀，腹腔内充满微黄泛红色液体，肠道有积液。传统治疗方法是使用大剂量抗生素浸泡或口服，治疗效果不明显，也不稳定，患病鱼死亡率高达70％以上，经济损失巨大，严重制约了鲆鱼养殖业的健康发展。长期大剂量使用抗生素，不仅没有获得良好的治疗效果，在严重污染环境的同时，还产生了耐药性，抗生素在鱼体内的残留还产生了食品安全问题，引起人们的高度关注。随着鱼类免疫学的快速发展，免疫成为防治疾病发生和流行最有希望、最有效的途径。

为此我们开展了养殖鲆鱼腹水病流行病学调查研究，应用定点调查和普查相结合、集中调查和跟踪调查相结合的方法，掌握养殖鲆鱼腹水病发生流行规律，通过分离纯化和回感实验筛选致病菌，应用生理生化和分子生物学相结合的方法鉴定致病病原菌为：迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)，两种菌单独或同时感染养殖鲆鱼均可导致腹水病的发生。迟缓爱德华氏菌是一种革兰氏阴性肠道病原菌，感染宿主范围广，危害大。在水产养殖生物中，该菌是鱼类(鳗、鲇、鲆等)、两栖类(蛙)、爬行类(鳖、鳄鱼)的重要致病菌。爱德华氏菌病(Edwardsiellosis)是水产养殖中最常见的传染病之一，不仅影响了养殖生物的健康，并对水产养殖业危害巨大。溶藻弧菌是一种革兰氏阴性短杆菌，广泛存在于海水中，海湾地区较多，在有些海湾是弧菌的优势种，其数量与海水温度、盐度和有机物质含量呈正相关。可引起多种水生动物发生疾病，南美白对虾细菌性红体病，中国对虾褐体综合症，养殖鲑点石斑鱼、点带石斑鱼、鮸状黄姑鱼、军曹鱼以及大黄鱼的溃疡病，三疣梭子蟹肌肉乳化病、养殖鲍急性死亡症等均是感染溶藻弧菌所致。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗。本

发明的第二个目的是提供一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗的制备方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗，用下述方法制成：

(1)制备迟缓爱德华氏菌灭活菌苗：将迟缓爱德华氏菌菌株活化，接种在固体培养基或液体培养基中，32℃～37℃培养24h～48h，当所述迟缓爱德华氏菌生长至平台期时收获，灭活，进行检验，检验合格后即制成迟缓爱德华氏菌灭活菌苗，所述固体培养基为2216E培养基或将15～25gNaCl添加到1升普通营养琼脂培养基中制成的培养基，所述液体培养基是将15～25gNaCl添加到1升营养肉汤培养基中制成的培养基；

(2)制备溶藻弧菌灭活菌苗：将溶藻弧菌菌株活化，接种在固体培养基或液体培养基中，28℃～35℃培养24h～48h，当所述溶藻弧菌生长至平台期时收获，灭活，进行检验，检验合格后即制成溶藻弧菌灭活菌苗，所述固体培养基为2216E培养基或将15～25gNaCl添加到1升普通营养琼脂培养基中制成的培养基，所述液体培养基是将15～25gNaCl添加到1升营养肉汤培养基中制成的培养基；

(3)用质量体积百分比浓度为0.85％的生理盐水或pH＝7.2、0.1M的无菌磷酸盐缓冲液分别将所述迟缓爱德华氏菌灭活菌苗和所述溶藻弧菌灭活菌苗调整浓度为10⁸CFU/mL～10¹²CFU/mL，再按迟缓爱德华氏菌:溶藻弧菌数量比为1:0.1～3的比例混合均匀，即制成一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗。

所述灭活为热灭活或化学方法灭活。

所述热灭活的温度为60℃～70℃，灭活时间为24h～30h。

所述化学方法灭活所用灭活剂为甲醛或苯酚，所述加入甲醛后的终体积百分比浓度为0.1％～1.0％，所述加入苯酚后的质量体积百分比浓度为1.0％～2.0％，温度为20℃～35℃，时间为48h～96h。

一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗的制备方法，是由下述步骤组成：