[发明专利]表达新城疫病毒NP基因的重组T4噬菌体的构建及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及表达鸡新城疫病病毒核壳蛋白基因(NP)的重组T4噬菌体的构建和应用。本发明进一步涉及重组T4噬菌体在新城疫病疫苗和新城疫病病毒抗体检测中的应用。

背景技术

新城疫病病毒(NDV)属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)Avulavirus属的模式种，它是鸡新城疫病的病原。该病毒的基因组，由NP、P、M、F、HN、L六个蛋白基因组成。其中的NP(又有缩写为N的)基因，由于其在基因组的RNA复制时起非常重要的作用，一直是多年来许多研究工作注重的焦点。

自首次在大肠杆菌中表达NDV的蛋白基因以来，NDV所有的蛋白基因，先后在各种表达系统中进行了表达。特别是NDV特主要NP基因，已先后在大肠杆菌、酵母等表达系统中进行了表达。但还没有用噬菌体表达NDV结构蛋白的报道。

噬菌体表面展示技术(phage display)是1980年代发展起来的一项新的生物技术(Smith，1985)，它能将表达的外源多肽和蛋白质以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，并保持相对独立的空间构象和生物活性。T4噬菌体属于有尾噬菌体中A群A2亚群的典型成员，其基本形态结构是头长径约95nm，横径约为65nm。T4噬菌体衣壳由3种必需衣壳蛋白组成，主要的衣壳蛋白gp23和2个次要衣壳蛋白gp24，gp20。其中分子量为45kDa的gp23在每个病毒颗粒中有960个拷贝，而其余2个次要衣壳蛋白拷贝数较少，gp24有55个拷贝，而gp20只有12个拷贝。此外，在衣壳的外表面包被着2种非必需外壳蛋白：分子量为9kDa的SOC和分子量为40kDa的HOC，二者相距7nm，以对称的形式分布于噬菌体二十面体表面。SOC和HOC仅提供噬菌体额外的稳定能力，是在噬菌体衣壳装配完成后才组装到衣壳表面的，它们的缺失不影响T4噬菌体的繁殖和感染。将外源蛋白与T4噬菌体表面的SOC或者HOC蛋白形成融合蛋白，从而可以获得具有外源蛋白的重组T4噬菌体。采用这样的方法，获得了表达爱滋病毒(HIV)gp120 V3肽、脊髓灰质炎病毒VP1(Ren et al，1996)、脑膜炎奈氏菌PorA(Jiang et al，1997)抗原蛋白的重组T4噬菌体。

发明内容

本发明的目的在于获得表达鸡新城疫病病毒核壳蛋白基因(NP)的重组T4噬菌体，为新城疫病疫苗的研制和新城疫抗体的检测提供一种新的抗原。

本发明提供的重组T4噬菌体是采用基因重组的方法获得的。其构建方法是：

(1)NP基因的PCR扩增，其操作步骤如下：

将pGEP-NP重组质粒作为PCR扩增模板，PCR反应体系为10×PCR缓冲液10μL，10×Enhancement缓冲液10μL，dNTP(各2.5m mol/L)810μL，上、下游引物各410μL，pfx DNA聚合酶1μL，用去离子水补足100μL。PCR反应条件为：94℃5min；94℃50s，56℃50s，72℃90s，30个循环后，72℃10min。取3μL PCR样品于10g/L琼脂糖凝胶中电泳观察。其余PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳，用胶回收(小量)试剂盒(购自上海华舜生物技术工程有限公司)回收纯化PCR产物。

(2)将新城疫病病毒NP基因的cDNA片段插入pET30a质粒中，构建重组整合质粒pET30a-NP，其操作步骤如下：

用Hind III和Not I在37℃分别消化NP基因的PCR产物和质粒pET30a，接着在T4连接酶的作用之下，连接消化的NP的PCR产物和质粒pET30a。用连接产物转化大肠杆菌DH_5α。经Amp′抗性筛选，获得插入了NP基因的重组子。参考NDV国内标准强毒株序列(F₄₈E₉)，合成了1对引物。NP-upper：5′-TGAGAAGC TTGCATGTCTTCCGTATTTGATGAG-3′，NP-lower：5′-ATGCGGCCGCTCAATACCCCCATGT CG-3′进行PCR筛选。对PCR筛选阳性的细菌，挑取单菌落接种于3mL LB培养基中，37℃，2000r/m振摇培养16-20h，抽提质粒，再经限制性内切酶消化和序列测定，获得重组整合质粒pET30a-NP。

(2)用重组整合质粒pET30a-NP和缺陷性T4噬菌体T4-Z1(Ren et al，1996)进行同源重组，获得表达VP2蛋白的重组T4噬菌体，其操作步骤如下：